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RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞
目的扩增人核糖体蛋白L23(RPL23)编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR,以进一步研究RPL23基因与胃癌多药耐药的关系. 方法按文献报道的RPL23核苷酸序列设计合成PCR引物,利用总RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序列测定证实后,通过双酶切,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,酶切电泳鉴定. 采用脂质体介导的方法将pcDNA3.1(+)-RPL23转染SGC7901细胞,pcDNA3.1(+)-anRPL23转染SGC7901/VCR细胞,经G418筛选后,随机挑选细胞克隆. 通过斑点杂交检测正、反义转染后RPL23 mRNA表达水平的变化. 结果应用RT-PCR反应扩增获得大小约0.5 kb的特异性片段. 经DNA序列分析,证实与文献报道的人RPL23编码区序列一致. 重组正义真核表达载体pcDNA3.1(+)-RPL23双酶切产生大小约5.4 kb,0.5 kb的片段;重组反义真核表达载体pcDNA3.1(+)-anRPL23双酶切产生大小约5.4 kb,0.5 kb的片段,均与预期结果相符.转染细胞经筛选后,随机挑选,扩增了2个细胞克隆,斑点杂交提示反义转染后RPL23mRNA表达水平显著下降,而正义转染后其表达水平明显增加. 结论成功克隆了人RPL23编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体. 在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞株,正义转染细胞中RPL23mRNA表达明显增加,反义转染细胞中表达明显受抑.
