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人硫氧还蛋白同ASK1的结合与硫氧还蛋白氨基酸位点的关系
目的:通过对硫氧还蛋白(Trx)突变体与凋亡信号调节激酶-1(ASK1)结合能力的研究,揭示Trx的氨基酸位点与其抗氧化抗凋亡性的关系,进一步阐述Trx在细胞凋亡中的作用.方法:构建人类野生型Trx(pcDNA-hTrx-His tag,TrxA)和人类Trx49位突变体(pcDNA-hTrx-Y49F-His tag,TrxB)及ASK1质粒(pCDNA-ASK1-HA tag).用TrxA、TrxB质粒分别与ASK1质粒共转染入HEK-293A细胞.实验分为对照组(CON)、ASK1质粒转染组、TrxA+ASK1质粒共转染组及TrxB+ASK1质粒共转染组.于转染24 h后,裂解细胞,裂解细胞前20min加入不同浓度的过氧化氢.将裂解产物进行Western blot检测转染的结果,运用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)法检测ASK1与Trx在过氧化物作用下解离的程度,采用TUNEL法及检测Caspase-3的活性法检测HEK-293A细胞的凋亡.结果:与ASK1转染组细胞的凋亡指数(73.8±6.93)%及Caspase-3活性[(69.3±3.57)nmol/(h·mg蛋白)]相比,TrxA+ASK1共转染组细胞的凋亡率(49.8±4.62)%明显减少,Caspase-3的活性降低[(51.4±3.61)mol/(h·mg蛋白)],(P＜0.05).TrxB+ASK1共转染组的凋亡率(22.4±5.07)%更少,Caspase-3的活性降低更明显[(30.1±2.48)nmol/(h·mg蛋白)](P＜0.01).与TrxA+ASK1共转染组相比,TrxB+ASK1共转染组的细胞凋亡数及Caspase-3的活性下降更明显(P＜0.05).此外,在过氧化氢干预下,TrxB与ASK1的结合同TrxA与ASK1的结合相比较,前者更紧密.结论:Trx中第49位的酪氨酸突变为苯丙氨酸后,Trx与ASK1的结合能力增强,Trx抗凋亡的作用明显增加.说明Trx与ASK1的结合能力与Trx的氨基酸位点明显相关,进而可影响Trx抗细胞凋亡的能力.
关键词： 硫氧还蛋白 凋亡信号调节激酶-1质粒 细胞凋亡
