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人磷脂酰肌醇蛋白3文献资料
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人GPC3基因真核表达载体的构建及重组蛋白表达纯化
目的:人磷脂酰肌醇蛋白3是肝癌的诊断标志物和潜在治疗靶点.本研究目的在于获得足量的GPC3蛋白用于结构、功能及应用研究.方法:通过RT-PCR从人胎肝中克隆GPC3编码cDNA,利用XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,将GPC3ORF编码基因插入毕赤酵母表达载体pPICZ A中,构建真核表达质粒pPICZ A-GPC3.以该表达质粒转染毕赤酵母菌株GS115,在含有Zeocin的YPD平板上进行筛选.然后使用HRP标记的山羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行Dot blot筛选.对筛选获得的菌株进行诱导表达,表达上清经SDS-PAGE和Western blot检测.结果:筛选获得的阳性菌株诱导表达上清SDS-PAGE结果表明在预期位置观察到GPC3重组蛋白条带,且该蛋白条带与抗GPC3单克隆抗体(mAb)孵育后呈现特异性反应.工程菌株经高密度培养后,发酵上清中重组GPC3表达量约5 mg/L,进而通过阳离子交换层析从发酵上清中纯化了重组蛋白.结论:利用毕赤酵母表达并纯化了重组人GPC3蛋白,为进一步研究GPC3的结构和功能奠定了基础.
