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人FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因文献资料
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人FHL1各LIM结构域融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测
目的 构建人FHL1各LIM结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4融合蛋白,并对其活性进行检测.方法用PCR法从FHL1真核表达载体中扩增FHL1的LIM1/2、LIM1、LIM2、LIM3和LIM4基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,通过GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白雌激素受体α(ERα)的相互作用.结果 构建得到FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致；在Rossate菌中诱导表达出与预期大小相符的目的蛋白,经Western blot法检测,融合蛋白成功表达；纯化得到GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4五个融合蛋白,GST pull-down证明FHL1全长以及FHL1-LIM1/2、-LIM2蛋白可以和ERα相互作用.结论成功克隆FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因,并获得了活性良好的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4蛋白,为研究FHL1在乳腺癌中的作用奠定了实验基础.
