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葡萄糖调节蛋白75(GRP75)文献资料
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线粒体信号肽引导葡萄糖调节蛋白75-增强型绿色荧光蛋白(GRP75-EGFP)融合蛋白定位于线粒体
目的 构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位.方法 通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接.利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体.将上述重组基因克隆入pEGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染HeLa细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况.结果 成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒.各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在HeLa细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期.EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于HeLa细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周.结论 构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位.
