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Dishevelled2siRNA载体的构建和有效干扰质粒的筛选
目的 构建和筛选特异性抑制Dishevelled 2 (Dvl2)表达的siRNA载体,为进一步研究Dvl2在破骨细胞分化及骨重建中的作用、筛选调节骨重建潜在靶点而奠定基础.方法 根据目的基因设计5个siRNA靶点,与pMAGic 4.0载体形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞,含抗生素的LB琼脂平板上筛选转化子,菌落PCR鉴定阳性克隆,测序验证正确的转化子,质粒抽提,Lipofectamine 2000将质粒瞬时转染RAW264.7细胞,通过绿色荧光信号观察转染,实时定量RT-PCR检测Dvl2基因表达的变化.结果 菌落PCR和测序证实所构建的siRNA质粒目的基因大小、序列与预期相符,能有效抑制RAW264.7细胞Dvl2基因的表达,其中3号质粒抑制效率高.结论 成功构建并筛选出特异性抑制Dvl2 mRNA表达的siRNA载体,可用于包装病毒颗粒和构建Dvl2表达抑制的稳定转染RAW264.7细胞.
关键词： Dishevelled 2 siRNA RAW264.7细胞 破骨细胞 -
小鼠Dishevelled2表达质粒的构建及其在RAW264.7细胞中的表达
目的 构建小鼠Dishevelled 2(Dvl2)表达质粒,并检测其转染小鼠破骨前体细胞RAW264.7后的表达,为进一步研究Dvl2在破骨细胞分化和骨重建中的作用、筛选调节骨重建潜在靶点奠定基础.方法 根据GenBank小鼠Dvl2 cDNA序列设计两条特异性引物,提取RAW264.7细胞总RNA,以RT-PCR获得Dvl2的开放阅读框(ORF),并将其克隆到真核表达质粒pEZ-M29上,酶切电泳,测序鉴定构建的pEZ-M29/Dvl2质粒.用脂质体介导瞬时转染RAW264.7细胞,通过荧光显微镜观察转染效果,实时定量RT-PCR检测Dvl2基因表达情况.结果 成功构建pEZ-M29/Dvl2表达载体,酶切电泳和测序结果 与目的 基因相符;转染RAW264.7细胞后48 h,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达;实时定量RT-PCR可见实验组Dvl2基因较对照组强烈过表达.结论 成功构建小鼠Dvl2真核表达质粒pEZ-M29/Dvl2,瞬时转染小鼠破骨前体细胞RAW264.7可显著提高Dvl2的mRNA水平.
关键词： Dishevelled 2 表达质粒 RAW264.7细胞 破骨细胞
