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髓磷脂相关抑制物66小分子干扰真核表达载体构建与筛选
目的 构建并筛选出具有干扰作用的髓磷脂相关抑制物66(neurite outgrowth inhibitory 66,nogo66)小分子干扰RNA(samll mterfenng RNA,siRNA)真核表达载体,为进一步构建腺相关病毒载体奠定基础. 方法 设计2条针对大鼠nogo66基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和1条阴性对照序列,插入载体pGenesil-1.1,同时用pGenesil-1.1质粒作为空白对照,得到4种质粒pGenesil-nogo66-siRNA.1、pGenesil-nogo66-siRNA-2、pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb,对4种质粒进行DNA测序和酶切鉴定;培养大鼠胶质细胞瘤C6细胞,用4种质粒进行转染,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白,检测转染效率;采用RT-PCR和Western blot分别检测nogo基因在mRNA水平和蛋白水平的表达差异,筛选出对nogo66基因具有干扰作用的nogo66-siRNA表达质粒. 结果 DNA测序显示设计的2种质粒干扰序列正确;Kpn,Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切4种质粒均可见800 bp及4.3 kb条带;4种质粒分别转染C6细胞后培养48 h,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达,平均转染效率约为73%.RT-PCR和Western blot检测显示:与未转染细胞相比,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使nogo基因表达下降22%、蛋白表达下降73%,转染pGenesil-no-go66-siRNA-2使nogo基因表达下降28%、蛋白表达下降78%,差异均有统计学意义(P<0.05);而转染pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb后nogo基因表达和蛋白表达均无明显下降(P>0.05). 结论 成功构建并筛选出具有干扰作用的nogo66-siRNA真核表达载体,为深入研究脊髓损伤修复奠定了理论基础.
关键词： 髓磷脂相关抑制物66 真核表达 载体构建 脊髓损伤
