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角质形成细胞培养基培养毛乳头细胞的实验研究
目的 毛乳头细胞被广泛用于组织工程毛囊和皮肤构建.探讨用含血清的角质形成细胞培养基(keratinocyte medium,KM)和普通培养基(normal medium,NM)培养毛乳头细胞的生物学特性差异,以及KM培养的毛乳头细胞是否可用于组织工程毛囊研究. 方法 采用两步酶消化法从除皱术时切下的头皮标本中分离培养毛乳头,接种后分别采用KM和NM培养毛乳头细胞并传代.记录毛乳头早贴壁时间及细胞迁出时间,接种5 d时统计毛乳头贴壁率.倒置显微镜下观察两组细胞形态学变化,计数第3代细胞每皿聚集体个数;记录细胞大传代次数;细胞融合成膜后取第3代细胞行MTT法检测细胞增殖;免疫荧光染色和ALP染色观察α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和ALP在两组细胞中的表达,并统计ALP蓝色阳性区域面积. 结果 KM组毛乳头早贴壁时间及细胞迁出时间分别为24h及64h,早于NM组的48 h及80h.5 d时KM组及NM组毛乳头贴壁率分别为54.17%及36.78%.NM组细胞体积较KM组大.NM组第3代细胞每皿形成(3.06±1.12)个聚集体,KM组每皿形成(9.25±1.73)个聚集体,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).KM组细胞融合后细胞膜片行HE染色可见细胞呈多层性;NM组细胞不能多层性生长,未行HE染色观察.NM组细胞多可传7代;KM组多可传15代.MTT检测显示KM组细胞增殖迅速,7 d后KM组吸光度值明显高于NM组,差异有统计学意义(P<0.05).免疫荧光染色显示,两组第3代细胞α-SMA均为阳性.ALP染色显示,NM组第6代细胞中仅少量细胞表达ALP,阳性区域面积为(987±146)μm~2;KM组第14代细胞ALP染色仍为阳性,阳性区域面积为(8 757±558)μm~2;两组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 毛乳头细胞在含血清的KM中增殖迅速,聚集生长明显,传代次数增多;用含血清KM培养毛乳头细胞用于组织工程毛囊构建是可行的.
