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大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的分析
目的 分析大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的改变. 方法 取健康3日龄SD大鼠骨髓分离培养BMSCs并扩增至第4代,体外构建自发钙化模型.于培养7、14d,倒置相差显微镜观察细胞生长状况及自发钙化进程,并行茜素红染色观察.分别于培养0、7、14 d时收集细胞进行基因芯片分析,并对差异表达基因进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)验证芯片分析结果. 结果 大鼠BMSCs在体外发生了自发钙化,并于培养7d后细胞开始堆集,茜素红染色为弱阳性;培养14 d后细胞堆积明显并形成典型的茜素红染色阳性钙结节样结构.自发钙化过程中共检测到576个差异表达的基因探针,对应378个大鼠基因.其中0d和7d相比有359个差异表达的基因探针,而7d和14d相比只有13个差异表达的基因探针.差异表达基因依据表达模式不同可分为6类;依据生物学功能亲和关系,与骨细胞生物学密切关联的差异表达基因又可分为7大类,即血管生成、细胞凋亡、骨相关基因、细胞周期、发育、细胞通讯和成骨信号通路.基因功能关联性分析显示有12个在功能上联系密切的细胞周期类基因在自发钙化过程中发生了下调;此外,基质金属蛋白酶13 (matrix metalloproteinase 13,Mmp13)、分泌型磷酸蛋白1 (secreted phosphoprotein 1,Spp1)、Cxcl 12、Mmp2、Mmp3、Apoe和Itga7与较多的差异表达基因存在功能上的联系.Spp1、Mgp、Mmp13、Wnt抑制因子1、Cxcl12和细胞周期素A2的RT-qPCR验证结果与基因芯片结果一致. 结论 细胞接种后的前7d是决定大鼠BMSCs自发钙化的关键期.BMSCs自发钙化过程受细胞通讯类基因、骨相关基因、细胞周期类基因、TGF-β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路和Wnt信号通路等多方面的共同调控.
