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CGT52TGT和GGA57GAA甘露聚糖结合凝集素突变体的构建
目的构建CGT52TGT和GGA57GAA 2种甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因突变体.方法设计2对引物52F/52B和57F/57R(R中引入了点突变),以含汉族人野生型MBL cDNA的重组质粒pGEM-mbl为模板,采用TaKaRa MutanBEST突变试剂盒进行定点突变,以PCR和测序分析进行鉴定.结果分别用52F/52R和57F/57R为引物对进行PCR,均得到1个约3 800bp的DNA片段,自身连接后获得重组质粒.以SP6/T7P为引物对进行PCR,获得约900bp的扩增产物.序列分析表明,2种克隆分别除其第52、57位密码变为TGT、GAA外,其余与野生型MBL cDNA完全相同.结论构建成功CGT52TGT和GGA57GAAMBL基因突变体,为深入探索MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机理和MBL分子的结构-功能关系提供了分子模型.
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37Glu突变型MBL蛋白在CHO细胞中的表达及其生物学特性研究
目的:探索甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因GGA57GAA点突变引起免疫缺损的机制.方法:采用PCR从质粒pMBLm57中扩增含GGA57GAA点突变的MBL基因,构建重组真核表达载体,电转染CHO细胞,以Zeocin筛选并克隆化培养,用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot、ELISA、配体结合试验、C4d沉积试验等鉴定目的蛋白.结果:重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株;37Glu突变型MBL蛋白主要以双链(Mr约60000)存在,不能形成高聚体;其配体结合能力低下,与MASP-2N端蛋白的结合能力也降低,不能通过凝集素途径激活补体系统.结论:GGA57GAA点突变产生结构有缺陷的MBL蛋白,进而影响其识别功能和效应功能.
