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FspE Ⅰ内切酶文献资料
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分枝杆菌表达质粒的快速构建及ClpC2基因功能初步研究
目的 通过一种不受到序列限制、酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建分枝杆菌ClpC2重组表达质粒,检测其在耻垢分枝杆菌中的蛋白表达并对其功能进行初步探讨.方法 利用识别甲基化位点的内切酶FspEⅠ进行一步法酶切、连接反应,构建重组质粒PMV261(+)-ClpC2.将重组质粒转入耻垢分枝杆菌,利用SDS-PAGE和Western blot检测ClpC2基因在耻垢分枝杆菌中的表达以及氧化应激、酸应激对其功能进行初步探讨.结果 利用FspE Ⅰ快速构建了分枝杆菌表达质粒ClpC2,将其成功电转至耻垢分枝杆菌中,SDS-PAGEA和Western blot检测其蛋白的表达,His单抗和兔多抗均能检测到目的条带,Mr大小27 570.氧化应激及酸应激实验表明ClpC2重组耻垢分枝杆菌与空载耻垢分枝杆菌在对抗应激方面无明显差异.结论 成功构建了一种不受序列限制的分子克隆方法以及分枝杆菌ClpC2重组表达质粒,Western blot表明其具有一定的免疫原性,氧化应激及酸应激表明ClpC2重组耻垢分枝杆菌对抗应激方面无明显改变,为进一步深入研究ClpC2基因的功能奠定了基础.
