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抗菌肽PR-39真核表达载体的构建及表达检测
目的:构建富含脯氨酸精氨酸的39位氨基酸抗菌肽(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)的真核表达载体,并检测它在293 T细胞中的表达情况.方法:以含有PR-39核心编码区(Core ceding regions,CDS)序列的质粒pBluescript ⅡSK-PR-39为模板,PCR扩增PR-39 CDS序列并测序.扩增片段插入真核表达质粒pGC-FU中,构建包含PR-39基因的重组表达质粒pGC-FU-PR-39.阳性克隆用限制性内切酶酶切及测序鉴定后用脂质体2000转染293 T细胞,荧光显像观察其转染效率,Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:成功扩增出PR-39基因,通过酶切测序鉴定证明成功构建了包含PR-39的真核表达载体pGC-FU-PR-39,转化293 T细胞24 h后观察到荧光,Western blot检测到目的蛋白.结论:本实验成功构建PR-39真核表达载体,并能在293 T细胞中表达PR-39-GFP融合蛋白,这为进一步研究PR-39的作用奠定了基础.
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慢病毒介导抗菌肽PR-39基因在免骨髓间充质干细胞中的表达及抗菌活性检测
目的 构建脯氨酸精氨酸抗菌肽(proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)慢病毒载体,并转染兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC),检测其在BMSC中的表达及抗菌活性.方法 PCR扩增目的 克隆,并连接入慢病毒载体质粒pGC-FU中,与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0在脂质体2000介导下共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,Real-Time PCR法检测其滴度;分离培养BMSC,BMSC转染PR-39慢病毒,荧光显微镜观察及流式细胞仪检测其转染效率,RT-PCR检测PR-39基因表达,并检测PR-39抗菌活性.结果 成功包装出滴度为2×10~9TU/mL的PR-39慢病毒载体,并转染BMSC,转染72 h后可观察到细胞呈现绿色荧光,转染效率为74.09%,同时RT-PCR检测BMSC表达PR-39基因,其上清液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌率为98.43%(P＜0.05).结论 在慢病毒介导下,BMSC成功表达分泌具有较强抗菌活性的抗菌肽PR-39.
