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融合蛋白/生物活性文献资料
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人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定
目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化.方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段,利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中.利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性.转化大肠杆菌BL21(DE)3,用异丙基b-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达.以尿素对获得的包涵体进行处理,用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性.以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定.结果克隆的hsRAGE完全正确,经过表达与纯化,获得了相对分子质量约45 000的融合蛋白.纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别.所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性,并能够抑制AGE诱导的内皮细胞NF-kB的表达.结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达,得到大量的复性蛋白;该蛋白具有特异的免疫原性,保持与AGE的结合活性,并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用.
