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EYA4通过抑制NF-κB依赖的RAP1反式激活抑制肝细胞癌的生长和侵袭
背景与目的 我们之前研究表明,眼缺失蛋白同源物4(eyes absent homolog 4,EYA4)是果蝇眼部发育相关的眼缺乏蛋白家族成员之一,在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)标本中常发生甲基化和沉默,并与患者生存期短密切相关.本研究旨在探讨EYA4在HCC中作为肿瘤抑制因子的作用机制.方法 转染EYA4表达质粒(Peya4)构建稳定表达EYA4的人HCC细胞系Huh-7和PLC/PRF/5(PLC).通过BALB/c裸鼠皮下注射稳定转染细胞建立异种移植肿瘤.组织标本来自75例病理诊断为HCC的患者.采用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学的方法检测EYA4在细胞系、异种移植物和临床标本中的表达;研究了稳定转染细胞系的细胞增殖、克隆形成、侵袭性和肿瘤形成.利用基因表达芯片筛选EYA4调节的基因.通过共转染EYA4和带Flag标签的RAS相关蛋白1A(RAS-related protein 1A,RAP1A)基因的表达质粒(Peya4和Flag-RAP1A)、功能研究、染色质免疫共沉淀、免疫荧光染色和细胞泛素化分析等方法,研究了EYA4对核因子-Κb(nuclear factor-Κb,NF-Κb)/RAS相关蛋白1(RAS-related protein 1,RAP1)信号通路的影响.结果 恢复HCC细胞系中EYA4的表达可抑制细胞的增殖、抑制克隆形成、降低细胞的侵袭性和抑制异种移植肿瘤生长,在体外实验中Flag-RAP1A可逆转Peya4的抑制作用.用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)激活NF-Κb通路可增加p65与RAP1A基因启动子的结合并上调RAP1蛋白的表达.用BAY 11-7085和p65 siRNA抑制NF-Κb通路,成功阻断了TNF-α诱导的RAP1上调.EYA4拮抗了TNF-α诱导的NF-Κb抑制因子α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)的磷酸化和泛素化以及p65的核易位和反式激活,进而抑制了NF-Κb的活性和RAP1的表达.用calyculin A阻断EYA4的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性可显著消除其对NF-Κb活性的抑制作用.此外,EYA4的表达与HCC临床标本中IκBα/RAP1活性呈负相关.结论 我们的研究结果为明确EYA4是真正的肿瘤抑制因子提供了功能和机制的理论基础,该肿瘤抑制因子可抑制NF-Κb/RAP1信号通路的异常激活,从而抑制HCC生长和侵袭.
