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末端标记引物延伸反应对核酸单碱基辨认的实验研究
目的探讨高保真DNA聚合酶的校正机制在核酸序列单碱基识别中的可能性.方法采用三末端氚标记的引物与配对及不完全配对的模板进行引物延伸反应,对延伸产物片段进行放射性活性的检测.结果当引物与模板配对时,其延伸产物含有可探测标记信号.当引物三末端与模板在单碱基水平不配对时,其延伸产物则不含可探测标记信号,表明引物三末端带有标记信号的碱基在高保真酶的错配纠正过程中被切除.结论高保真酶的错配纠正机制与引物的三末端标记结合,能够有效辨认核酸序列单碱基,提示该方法可用于单碱基多态性检测.
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高保真DNA聚合酶在SNP检测中的应用
DNA测序技术,使人类步入了后基因时代;而后基因时代对DNA序列分析的新要求,尤其是有关单碱基多态性的检测,急需更高效和更特异的分析方法.作者介绍两种可靠性高且适应性广的单碱基多态性检测新方法.基于高保真DNA聚合酶对引物3′末端错配碱基的校正机制,通过标记引物3′末端,配对引物得到带标记信号的产物而不配对的引物则只能得到不含标记信号的产物.近,我们新发现高保真DNA聚合酶具有通过聚合反应非成熟性终止以维持成熟性终产物保真度的能力.利用3′硫化磷酸修饰的引物,可强化由不配对引物所激发的对聚合反应的终止作用.3′硫化磷酸修饰与高保真DNA聚合酶共同形成一种由单碱基多态性调控的分子开关.这一新的分子开关可与电泳等多种现有的技术联合使用,在分析单一或多个已知SNP位点时,具有极大的应用价值.
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遗传、高保真DNA聚合酶、基因检测
遗传与变异是生物进化和生命活动基本和永恒的主题.其中,遗传物质在个体和物种中如何维持其稳定性,更是当代生物医学研究中的热点.高保真DNA聚合酶通过其著名的校正或称之谓错配碱基修复机制,参与了遗传物质稳定性的维持[1,2].高保真DNA聚合酶除含有聚合酶活性外,该酶分子同时具有3′→5′外切酶活性,正是通过此外切功能对有待延伸的引物或DNA复制过程中新生DNA链三末端或近三末端不配对碱基的校正,使DNA合成终产物的保真度得到了维持[3].
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校正PCR在性别鉴定中的应用
目的 研究校正PCR在性别鉴定中的可应用性.方法 采用突变敏感性"分子开关"介导的PCR针对Y染色体特定序列进行识别.实验包括三个方面:采用普通PCR,针对Y染色体M45(n2032631)位点设计特异性引物结合突变敏感性分子开关,对已知性别的样本进行检测;采用实时定量PCK和突变敏感性"分子开关",以及Y染色体特异性引物YO2对已知性别的样本进行检测;采用Y染色体特异性引物YO2对未知性别的男女模板进行检测.结果 本实验对所采用的小数量样本,在已知性别组与未知性别组的性别鉴定上均达到检测性别与实际性别完全相符,预示着该方法在性别鉴定上的巨大潜在应用价值.
