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HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因真核重组载体的构建和鉴定
目的:构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒(HBV)HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.方法:采用PCR法扩增HBcAg基因,并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个Nhe I酶切位点,然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoR I和BamH I之间.同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因,并在其两端分别引入Nhe I酶切位点,通过酶切、连接,将这段基因插入到HBcAg基因的Nhe I酶切位点上.将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.结果:酶切鉴定示,插入片段大小均与预计相符.测序结果与已知序列结果一致.结论:成功构建了HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.
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重组HBcAg激活p38MAPK信号通路增加髓源性树突状细胞IL-15的分泌
目的 探讨重组人乙型肝炎病毒核心抗原(rhHBcAg)诱导髓源性树突状细胞(mDC)分泌白细胞介素15(IL-15)的机制.方法 采用人单核细胞磁珠负分选试剂盒分选外周血单核细胞,采用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导分化为mDC,10 μg/mL rhHBcAg刺激mDC 1～6 d;分别用25 μmol/L磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3 K/Akt)信号通路抑制剂LY294002、1.μmol/L p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)信号通路抑制剂SB203580、100 nmol/Lc-Jun N末端激酶(JNK)信号通路抑制剂SP600125和150 nmol/L胞外信号调节激酶(ERK)信号通路抑制剂U0126预处理1h,再给予10 μg/mL rhHBcAg刺激48 h.之后收集细胞和细胞培养上清,实时定量PCR检测IL-15 mRNA水平,ELISA检测IL-15蛋白水平,Western Mot法检测PI3K/Akt和MAPK信号通路分子磷酸化水平.结果 与rhHBcAg未刺激组比较,rhHBcAg刺激组IL-15 mRNA和蛋白水平显著升高;与rhHBcAg刺激组比较,p38抑制剂预处理组IL-15水平明显降低,但PI3K/Akt、JNK和ERK抑制剂预处理组IL-15水平未见显著性改变.结论 rhHBcAg通过p38MAPK信号通路上调外周血mDC IL-15的分泌.
