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RNA 结合蛋白 QKI 吸附海绵载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响
目的：构建针对 RNA 结合蛋白 quaking (QKI)的特异性吸附海绵载体(QRE-sponge),验证其对肝癌细胞系 HepG2中内源性 QKI 分子的抑制作用。方法利用人源 QKI 的特异性识别效应原件(qua-king responsive element, QRE)序列,重复13个拷贝,串联克隆至 pEGFP-C2真核表达载体中,转染 HepG2肝癌细胞及293 T 细胞。通过 Real time PCR,双荧光素酶报告基因检测及 MTT 实验进一步验证该吸附海绵的效果及其对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。结果 pEGFP-C2-QRE-SP 载体经测序证实构建成功,可以成功的在 HepG2细胞中表达,其绿色荧光呈阳性,且转染24 h 后显著影响 HepG2细胞中 QKI 下游靶基因的表达(P ﹤0.05)。双荧光素酶报告基因系统显示, pGL3-QRE-SP 载体可以显著抑制外源性 QKI 的活性(P﹤0.05)。 MTT 结果显示 pEGFP-C2-QRE-SP 载体促进 HepG2细胞的增殖。结论 QKI 吸附海绵载体策略构建的 pEGFP-C2-QRE-SP 载体可以成功的诱骗吸附 QKI,并促进肝癌细胞系 HepG2增殖,为进一步研究 QKI的功能研究提供了良好工具。
关键词： RNA 结合蛋白 quaking 吸附海绵载体 肝癌细胞 -
miR-181a吸附海绵载体改善肝细胞胰岛素抵抗作用研究
目的：构建对肝癌细胞系 HepG2中内源性成熟miR‐181a具有的抑制作用的特异性吸附海绵载体（miR‐181a‐sponge），验证其在葡萄糖胺诱导的 HepG2细胞胰岛素抵抗模型中改善胰岛素敏感性的作用。方法：针对成熟人源 miR‐181a的序列，设计在9‐12位发生突变的反义序列，并重复7个拷贝，串联至pEGFP‐C2真核表达载体及pGL3‐Promoter载体中，通过双荧光素酶报告基因系统验证该吸附海绵的效果；同时在葡萄糖胺诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型中转染miR‐181a吸附海绵载体，检测细胞对胰岛素刺激的应答效果。结果：pEGFP‐C2‐181a‐SP载体可以成功的在细胞中表达，其绿色荧光呈阳性。双荧光素酶报告基因系统显示，pEGFP‐C2‐181a‐SP载体可以显著抑制外源性miR‐181amimics的活性（P＜0．05）。Western blot结果显示转染pEGFP‐C2‐181a‐SP载体可以改善葡萄糖胺诱导的 HepG2胰岛素抵抗细胞模型对胰岛素的应答。结论：miR‐181a吸附海绵载体策略可以成功的诱导吸附miR‐181a ，构建的pEGFP‐C2‐181a‐SP载体基因显著增加HepG2细胞的胰岛素敏感性，为改善miR‐181a导致的肝细胞胰岛素抵抗提供了潜在的解决方案，有可能成为2型糖尿病治疗的新策略。
