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C.elegans的学习记忆异常基因及其功能的研究
目的 探索学习记忆异常基因hab-1(cn308)的功能.方法 1. 在hab-1领域有Y63D3A.6、Y63D3A.7和Y63D3A.8等三个YAC克隆.在基因库里检索Y63D3A.6、Y63D3A.7和Y63D3A.8的cDNA序列,用DNASIS-Mac v3.6软件处理并设计引物,进行PCR.把PCR产物插入pMD~(TM)18-TVector载体,并培养提取Y63D3A.6、Y63D3A.7和Y63D3A.8的目的 DNA,纯化DNA.2.进行rescue实验:把三种YAC克隆(clone)Y63D3A.6、Y63D3A.7和Y63D3A.8的DNA分别与GFP蛋白连接配制融合蛋白.应用OLYMPUSAxiovert S100共聚焦倒置显微镜操作系统,在L4大小的C.elegans生殖腺(gonad)内分别把三种GFP融合蛋白溶液显微注射,发育传代至F1.在F1代选择带有GFP荧光的C.elegans,观察基冈的表达部位,并进行Tap测试,通过观察在哪个YAC克隆把hab-1(cn308)的表现型恢复为野生型来确定hab-1的等位基因.3. DNA测序和同源性检索:hab-1的等位基冈确定以后对cn308进行DNA测序.根据cn308的测序结果与已知的等位基因DNA序列进行Homology search,分析cn308的基因结构,并进行BLSTP homologic search,和其他物种比较目的 基因的功能来阐明hab-1的基因功能.结果 对Y63D3A.6、Y63D3A.7和Y63D3A.8等三种基因表达率进行χ~2检验结果表示差异有显著性(χ~2=26.84,P<0.05).表明Y63D3A.6、Y63D3A.7、Y63D3A.8等三种基因虽然迮锁于第一常染色体上邻近的位置.但在C. elegans的头部表达率无关联性,并有显著性差异.同时可见Y63D3A.7强表达于C. elegans的头部,Tap测试证明Y63D3A.7把hab-1的表现型恢复野生型.DNA测序结果表明hab-1(cn308)是GAG错义突变为GGG,即Glu→Cly的突变体.BLSTP homologic search结果表明Y63D3A.7是调节线粒体complex Ⅰ的活性,就是说明hab-1基因与线粒体complex Ⅰ的功能有关.结论 Y63D3A.7是hab-1的等位基冈,主要表达于中枢神经系统.C.elegans的学习记忆机能低下与hab-1的突变影响线粒体complex Ⅰ的功能有关.
关键词： Tap刺激 hab-1 线粒体complex Ⅰ 学习记忆
