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地高辛标记的金黄地鼠RPL30cDNA探针的制备和应用
目的 制备地高辛标记的核糖体蛋白RPL30cDNA探针并用其研究RPL30在神经管发育过程中的表达状况.方法 利用分部分排除技术(SSS法)从金黄地鼠神经管cDNA文库中逐级筛选得到RPL30cDNA的全长序列;随机引物法制备地高辛标记RPL30cDNA探针,点杂交法检测探针的灵敏度;Northern杂交检测神经管发育过程中RPL30mRNA的表达状况.结果 本研究从构建的神经管cDNA文库中得到RPL30cDNA片段,全长535bp;制备探针的浓度达到50mg/L;Northern杂交检测发现E8d～E12d神经管中RPL30mRNA的表达均处于较高水平.结论 该研究结果为进一步探讨RPL30与神经管发育和神经管畸形发生之间的关系奠定基础.
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RPL30基因的克隆及其与神经管发育相关关系的研究
本文通过构建金黄地鼠神经管cDNA文库,筛选了RPL30基因,并探讨了其与神经管发育的关系.提取胚胎(E)8.5 d的金黄地鼠神经管总RNA,用SMART技术构建神经管cDNA的噬菌体表达文库.利用分部分排除技术(SSS法),结合PCR法逐级筛选cDNA文库.将得到的RPL30阳性噬菌斑进行质粒转化、酶切鉴定及测序分析,进而回收、纯化RPL30 cDNA片段并制备探针.用Northern杂交技术检测神经管发育过程中RPL30 mRNA的表达状况.结果显示,构建的神经管cDNA文库容量为1.5×106 pfu/ml,重组率达到99%,平均插入片段长度大于1 kb.经过筛选得到含RPL30 cDNA的阳性克隆.序列测定及同源性分析发现,该cDNA片段全长535 bp,其中含有完整的开放阅读框.Northern杂交结果显示,在E8 d～E12 d各时间段,神经管中RPL30 mRNA的表达均处于较高水平,且随着时间的增长,表达量递增,于E12 d达到高峰.本文结果表明,我们用SSS技术结合PCR法从神经管cDNA文库中克隆到了RPL30基因的全长cDNA序列,该基因可能与神经管发育密切相关.
