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小鼠胚芽干细胞的分离与培养
目的:探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力佳时期.方法:分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况.结果:①在含15%胎牛血清的DMEM/F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子(LIF)或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6 d后出现鸟巢状胚芽干细胞集落.传4代后集落逐渐减少、变小.6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4 d即可见EGC集落形成.传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24 h后细胞呈对数生长.培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长.第5代的细胞增殖速度减慢.结论:与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞:第3代细胞的活力好.
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体外诱导小鼠胚芽干细胞分化为肝细胞的实验研究
目的 寻找一种诱导小鼠胚芽干细胞向肝细胞定向分化的佳诱导剂.方法 分离提取孕11 d小鼠胚胎的原始生殖细胞,体外培养扩增后,一部分胚芽干细胞接种到6 孔培养板中.向不同孔中分别加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、β-神经生长因子(β-NGF)、维甲酸(RA)、肝细胞提取液进行诱导分化.另一部分胚芽干细胞与胎肝组织共培养.将培养12 d的细胞采用靛青绿摄入试验和白蛋白(ALB) 免疫细胞化学染色来鉴定原始生殖细胞向肝细胞分化的情况.结果 与胎肝组织共培养和添加了β-NGF、肝细胞提取液的胚芽干细胞能够诱导成肝样细胞,这些肝样细胞能够摄取ICG并表达ALB,上述3组细胞ALB阳性细胞数较对照组明显增多(P＜0.05).bFGF、EGF、RA并无诱导分化作用.结论 β-NGF、胎肝组织产生的细胞因子及肝细胞提取液中的细胞因子可诱导小鼠胚芽干细胞向肝细胞分化.
