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抗降解作用文献资料
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突变型HIF-1α慢病毒载体的构建及其在常氧条件下的抗降解作用
目的 构建点突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)慢病毒载体,并检测其在常氧条件下的抗降解作用.方法 根据人的HIF-1α基因(NM_001530),对其全长编码区序列进行如下定点突变:803位天冬酰胺突变成丙氨酸,564位脯氨酸突变成丙氨酸,402位脯氨酸突变成丙氨酸.设计并合成3对引物用以导入变异点.PCR扩增序列片段,然后将目的 基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.PacI和AscI酶切鉴定后,用LR重组系统将目的 序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-MT(突变型HIF-1α)及Lenti-WT(野生型HIF-1α).将Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ(对照组)转染293T细胞后,采用qPCR检测目的 基因的表达.转染后的细胞在低氧条件下(2% O2)培养48 h,然后常氧条件下培养48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白在不同氧浓度条件下的表达情况.结果 与WT测序结果对比表明MT已被完成.酶切结果证明已成功构建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.qPCR结果显示Lenti-MT组目的 基因表达高于Lenti-WT组,且差异具有统计学意义.低氧条件下,HIF-1α在WT组和MT组中的蛋白表达差异无统计学意义.但常氧条件下培养48 h后,WT组目的 蛋白的表达显著下降,而MT组变化不大.上述结果表明MT具有明显的抗降解作用.结论 成功构建了突变型HIF-1α,慢病毒载体在常氧条件下,Lenti-MT具有显著的抗降解作用.
