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重组腺病毒介导人类白细胞抗原-G 基因转染恒河猴树突状细胞对 T 细胞的增殖作用
目的：人类白细胞抗原-G（HLA-G）通过与树突状细胞（DC）表面的免疫球蛋白样转录体（ILT2）和 ILT4（ CD85d）结合，广泛参与机体的免疫耐受的过程。探讨经HLA-G重组腺病毒载体感染后的恒河猴未成熟树突状细胞刺激T细胞的增殖作用。方法麻醉恒河猴获取新鲜骨髓血，采用密度梯度离心法，分离获得的单个核细胞行免疫磁珠法获得CD34＋细胞。添加小剂量细胞因子联合诱导分化CD34＋细胞，从而获得树突状细胞。介导HLA-G的重组腺病毒经过转染未成熟树突状细胞后，检测病毒感染效率，Western blot检测HLA-G在未成熟树突状细胞中的表达。以恒河猴T细胞作为反应细胞，将介导HLA-G的重组腺病毒转染的不同状态下的DC为刺激细胞，进行混合淋巴细胞实验。设置5组：即成熟树突状细胞组（ mDC组）；未成熟树突状细胞组（ imDC组）；imDC（ L）组：在第7天成功获得imDC后加入脂多糖100 ng／mL；imDC（ V）组：重组腺病毒介导HLA-G感染的imDC，方法同前；imDC（ L＋V）组：重组腺病毒同样转染imDC，同时在培养过程中添加100 ng／mL的脂多糖。根据DC与T细胞不同比例（1∶5、1∶10、1∶20、1∶40）计算各组刺激指数（SI）。结果成功培养获得恒河猴未成熟树突状细胞，HLA-G在该细胞中表达。流式细胞术检测结果发现DC的纯度高达92．3％，imDC组则高达72．39％， CD4＋T细胞阳性率纯度＞80％。混合淋巴细胞实验分析DC刺激T细胞增殖结果表明，不同DC与T细胞比例（1∶5、1∶10、1∶20、1∶40）下，imDC组SI为1．63±0．03、1．52±0．04、1．39±0．03和1．21±0．01；mDC组SI为2．23±0．05、2．01±0．031、．65±0．02和1．54±0．05；imDC（L）组SI为2．25±0．04、1．96±0．02、1．62±0．03和14．8±0．01；imDC（V）组SI为1．46±0．04、1．33±0．02、1．20±0．04和1．04±0．02；imDC（L＋V）组SI为1．67±0．031、．59±0．04、1．38±0．03和1．24±0．03。与imDC 组比较，mDC组、 imDC（L ）组SI明显增高（ P＜0．01）；与imDC（ V）组比较，imDC组、mDC组、imDC（ L）组、imDC（ L＋V）组SI明显增高（ P＜0．01）；与imDC（ L＋V）组比较，mDC组、imDC（ L）组SI明显增高（ P＜0．01）。结论重组腺病毒介导HLA-G转染的恒河猴未成熟树突状细胞能够有效抑制恒河猴T细胞的增殖。
关键词： 人类白细胞抗原-G基因 T细胞 免疫耐受 恒河猴 -
HLA-G短干扰RNA真核表达载体的构建及其在JEG-3细胞株中抑制HLA-G表达的研究
目的:构建HLA-G短干扰RNA表达质粒及探讨HLA-G的功能.方法:根据siRNA设计的原则,结合pSilencer2.1-U6-neo质粒的特点,针对HLA-G基因设计并合成两对寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo,将重组真核表达质粒pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G采用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株.应用RT-PCR、Western-blot等方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平;MTT法检测转染后JEG-3细胞增殖的变化.结果:RT-PCR和Western-blot结果均表明瞬时转染重组pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达.实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制.结论:pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒构建成功,可下调JEG-3细胞中HLG的表达,抑制绒癌细胞生长.
关键词： 人类白细胞抗原-G基因 RNA 干扰 JEG-3细胞系
