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3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位
目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白.方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag 标签的真核表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位.使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白.结果:hPAK4 全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp.Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白.结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白.3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中.
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灵芝对肝癌干细胞糖代谢和标志物蛋白的影响
目的:探讨灵芝对人肝癌干细胞糖代谢及标志物CD133蛋白的影响.方法:培养人肝癌SMMC7721细胞并用灵芝L08处理,用MTT法测定细胞的成活率,用试剂盒法测定己糖激酶活性,用Western Blot法测定CD133蛋白的水平.结果:灵芝L08处理人肝癌SMMC7721细胞后,细胞的成活率及己糖激酶活性都有所降低.同时,肝癌干细胞的CD133蛋白水平也降低.结论:灵芝L08能抑制人肝癌细胞的增殖、细胞中己糖激酶的活性和CD133蛋白水平.
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hβ- arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位
目的：构建 pEGFP - C1-β- arrestin2融合蛋白表达载体，并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法：以 pGEX -5X -1-β- arrestin2为模板，PCR 法扩增 hβ- arrestin2编码序列，亚克隆至 pEGFP - C1中， pEGFP - C1-β- arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞 HEK293，West-ern blot 检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在 HEK293细胞中的分布。结果：hβ- ar-restin2编码序列被成功克隆至 pEGFP - C1中，Western blot 检测到融合蛋白表达，分子量约为77kDa，pEGFP
关键词： hβ - arrestin2 基因 蛋白质印记 绿色荧光蛋白
