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Tet-off诱导表达Egr-1 HEK293稳定细胞株的建立和鉴定
目的:利用大肠埃希菌Tet-off诱导表达调控系统构建多西环素调控的稳定细胞株.方法:以pEGFPEgr-1质粒为模板,扩增含早期生长反应蛋白(early growth response-1,Egr-1)完整开放阅读框的DNA序列,经酶切后插入含四环素反应元件(tetracycline responsive element,TRE)序列的表达载体pTRE2hyg,获得重组质粒pTRE2hyg-Egr-1,将其转染293Tet-off细胞株,并用G418和多西环素筛选稳定表达Egr-1的细胞株.蛋白质印迹法检测多西环素诱导表达Egr-1情况;流式细胞术检测细胞增殖能力.结果:蛋白质印迹结果显示,外源性Egr-1蛋白表达受细胞培养液中多西环素调控,当从细胞培养液中去除多西环素后,Egr-1表达量明显升高.流式细胞检测结果显示Egr-1高表达细胞的增殖能力明显高于Egr-1低表达细胞.结论:利用Tet-off体系成功构建Egr-1诱导表达的细胞株,细胞的增殖能力受Egr-1表达水平的影响.
关键词： Tet-off调控系统 早期生长反应蛋白1 稳定细胞株 多西环素 -
Egr－1基因转染对糖尿病小鼠肾脏炎症反应的影响
目的：观察Egr－1基因转染对糖尿病小鼠肾组织肿瘤坏死因子α（ TNF－α）及细胞间黏附分子1（ ICAM－1）表达的影响，探讨Egr－1在糖尿病肾病发病机制中的作用。方法：制备糖尿病小鼠模型，成模后随机选取10只作为糖尿病组，剩余40只每周1次经尾静脉分别注射空质粒、Egr－1表达质粒和Egr－1 siRNA质粒，并设立正常对照组。实验共4周，于第4周末收集各组小鼠肾组织标本，分别应用western blot 和免疫组织化学染色测定肾组织中Egr－1、TNF－α和ICAM－1的表达；应用电镜观察肾小球超微结构的改变。结果：糖尿病小鼠肾组织Egr－1、TNF－α及ICAM－1表达增强，基底膜普遍增厚，系膜区基质增多，上皮细胞足突融合；Egr－1基因转染后上述变化趋势更加显著。siRNA质粒转染组上述变化较糖尿病组明显减轻。结论：Egr－1可上调TNF－α及ICAM－1表达，促进系膜细胞增殖及系膜外基质积聚，可能是加速肾小球硬化的可能机制之一。
