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应用抑制性ELISA法测定动物源性生物材料中α-Gal抗原
动物源性生物材料因其来源丰富且功能完备被广泛用于临床治疗,但由于其大量表达的α-Gal抗原(Galactosyl α-(1,3)-galactosyl β-1,4-N-acetylglucosaminyl,α-Gal epitopes)能够与人体内α-Gal抗体特异性结合,导致超急性移植排斥和慢性免疫毒性反应使移植失败.该研究以临床常见的动物源性生物材料作为研究对象,通过α-Gal抗原特异性单抗M86参与的抑制性ELISA方法,定量检测了材料中α-Gal抗原.实验结果表明,每毫克两种成品生物骨的α-Gal抗原含量为(3.9±0.73)×105～ (4.7±0.85) ×105个,明显少于同等重量的原材料牛骨组织,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).皮肤修复膜中α-Gal抗原含量亦少于其原材料牛皮组织(P＜0.05).同时,该抑制性ELISA方法具有良好的回收效率.由此表明,抑制性ELISA方法能够快速、特异性检测异种移植材料中α-Gal抗原含量,从而为α-Gal抗原相关的异种移植免疫学研究和临床应用提供实验依据.
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动物源性生物材料残留DNA的定量检测法
动物源性生物材料的残留DNA定量检测是产品脱细胞处理过程是否彻底,以及免疫原性风险是否得到有效控制的重要产品技术指标之一.目前,国际上还没有针对这类材料的残留DNA检测方法.本研究设计了动物源性生物材料的残留DNA定量检测三步法,即固体生物材料的蛋白酶K消化,DNA纯化和荧光染色法DNA测定,在整个实验过程中增加了回收率实验,经过回收率曲线方程校正后得到终检测结果.实验过程中的磁珠法DNA纯化步骤的优化设计保证了较好的回收率,同时满足了准确性和精密度.该实验方法经验证,其检测灵敏度达到6.25 ng/每份样品,回收率样品DNA含量在3.125～100 ng以及25～400 ng范围内线性良好,其回收率曲线R2＞0.99.此方法保证了生物材料中微量或痕量DNA检测的科学性和可信性.
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动物源性生物材料中残留α-Gal抗原检测方法
为了定量检测动物源性生物材料中残留α-Gal抗原含量,本实验室建立了M86抗体的ELISA抑制法.用兔血红细胞制备标准曲线,以Galα-1,3-Gal/BSA为固相抗原,利用特异性抗α-Gal单抗M86与待测物反应,再取上清液中剩余的M86抗体与固相抗原反应后检测待测物中α-Gal抗原含量.结果显示其标准曲线的R2=0.999,具有很好的相关性;经α-Gal阳性和阴性材料的验证证实其具有较好的灵敏性和特异性.利用该方法考察了大鼠组织、动物源性脱细胞生物材料、猪真皮处理前后α-Gal抗原的表达特征.该方法有望成为评价动物源性生物材料及其衍生物α-Gal抗原残留的一种有效方法.
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ELISA抑制法检测动物组织中α1,3-Gal抗原
目的:用人工合成的Gal/BSA抗原对骨髓瘤细胞的Gal抗原表位数进行赋值;再用骨髓瘤细胞作为参照品,建立并优化单克隆特异性抗体M86检测动物组织中αl,3-Gal(Gal)抗原的ELISA抑制法.应用优化后的方法,检测猪和小鼠组织Gal抗原表位数.方法:将待测物抗原(Gal-BSA系列稀释液、SP2/0细胞及待检组织样品)与M86特异性抗体反应后离心,取含有M86剩余抗体的上清液;再与Gal-BSA包被的同相抗原反应,计算出待测样品和标准曲线样品的M86结合抑制率;之后绘制相应的质量浓度-结合抑制率曲线,再根据曲线拟合公式计算其50％结合抑制时的质量浓度;进而计算Gal抗原表位数.结果:各结合抑制曲线相关性较好,R2 ＞0.95.SP2/0骨髓瘤细胞Gal抗原数为每个细胞6.19×108个;利用优化了的方法检测猪的冻干组织抗原含量趋势为:肺＞肾＞脾＞心＞腹膜＞心包膜＞肝组织＞皮肤;小鼠的新鲜湿组织抗原含量趋势为:心＞肺＞脾＞肾＞肝.结论:应用骨髓瘤细胞作为参照品,所建立的M86抗体ELISA抑制法检测动物组织的Gal抗原含量具有较好的敏感性和特异性,为进一步建立该方法规范性的行业标准奠定了基础.
