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Ni+柱亲和层析法文献资料
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Klenow(exo-)的表达、活性测定及其在焦磷酸测序中的应用
野生的Klenow聚合酶具有3′-5′外切酶活性,会对引物进行切割而造成焦磷酸测序产生错误的延伸信号.为了制备缺失3′外切酶活性的Klenow聚合酶用于焦磷酸测序反应,该研究全合成了外切酶活性缺失突变的Klenow酶基因编码序列,将其插入到表达载体pET28a(+)中构建重组质粒,并转化到大肠杆菌中,表达外切酶活性缺失的Klenow酶(Klenow(exo-)).通过优化诱导温度、诱导时间与诱导剂浓度,得到了Klenow(exo-)的佳表达条件为30℃时诱导表达5h且IPTG浓度为0.1 mmol/L.利用Ni+柱亲和层析法纯化得到了相对分子质量约为67 000的重组Klenow(exo-)酶,并建立了基于生物发光的酶活测定方法,终将其用于焦磷酸测序反应.结果表明,制备的重组酶具有良好的聚合酶活性但缺失了3′外切酶活性,可成功测定DNA待测模板序列,为焦磷酸测序技术提供了一个有效的关键酶.
