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Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达
目的 为了深入了解在胚胎发育过程中,尤其是在早期B淋巴细胞的生成和中脑的发育过程中pax5基因可能的作用及其机制,选择斑马鱼作为实验动物,构建野生型斑马鱼pCS2+ -pax5重组质粒,并观察pax5基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达.方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoR Ⅰ、XbaⅠ双酶切后,在T4DNA连接酶的作用下插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针.将得到的探针用全胚胎原位杂交技术检测pax5基因在斑马鱼早期发育过程中的表达.结果 成功构建pCS2+ -pax5重组质粒并制备了pax5基因的反义mRNA探针,通过斑马鱼原位杂交技术,发现在斑马鱼受精后18～72小时(18～72 hpf)胚胎头部的小脑、中脑后脑交界处均可观察到pax5基因阳性杂交信号；在24～72 hpf胚胎的耳蜗均可观察到pax5基因的阳性杂交信号,且随着时相的增长其表达逐渐增多；在18～48 hpf胚胎的脊索部位可见pax5基因的阳性杂交信号.结论 明确了pax5基因在斑马鱼胚胎的脑部、脊索神经系统高表达,并首次证实其在耳蜗听神经的早期发育过程中有表达,可能对斑马鱼早期胚胎神经系统的发育起着某些至关重要的作用.
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pCS2+-FLASH重组质粒的构建及斑马鱼FLASH基因反义mRNA探针的制备
目的 构建斑马鱼pCS2+-FLASH重组质粒,制备斑马鱼FLASH 反义mRNA探针.方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼FLASH基因片段,将得到的FLASH片段和pCS2+质粒用BamHⅠ及HindⅢ双酶切后插入pCS2+质粒,通过对重组质粒进行双酶切及插入片段序列测序鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成DIG-FLASH基因反义mRNA探针.结果 RT-PCR法扩增出长度为533 bp的特异性产物,构建的pCS2+-FLASH重组质粒经酶切鉴定和测序结果 与预期相符;用FLASH反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观察到FLASH在野生型斑马鱼神经系统中存在表达.结论 成功构建了pCS2+-FLASH重组质粒及FLASH基因反义mRNA探针.
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HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达
目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.
