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高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定
目的 构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)虫株. 方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段.将纯化的PCR产物克隆至pCR-BluntⅡ-Topo载体构建pROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列.将纯化的PCR产物亚克隆至pTUB8-mycGFPPftail-Ty1载体,构建pTUB8-ROP18-Ty1质粒.将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50 μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株.免疫荧光和蛋白质印迹(Westernblotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达.吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况.20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率. 结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列.经酶切和测序鉴定证明pTUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功.Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致.免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体.吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P＜0.05).弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30％ (3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30％ (3/10),至第9天全部死亡.结论 构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株.
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流行于我国的优势基因型弓形虫株毒力及其棒状体蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差异分析
目的 分析流行于我国的优势基因型弓形虫株(WH3株和WH6株)毒力差异以及棒状体蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差异,为研究其致病机制奠定基础.方法 使用弓形虫WH3、WH6、RH和PRU虫株分别感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠,观察小鼠存活时间和存活率,分析毒力强弱.同时PCR扩增4株弓形虫毒力相关效应分子棒状体蛋白ROP5和ROP18基因片段,核苷酸测序后将其转换为氨基酸序列,在蛋白水平上比较其序列差异.结果 此4株弓形虫株中,WH3和RH株对BALB/c小鼠和昆明鼠均有较强的毒性,两种小鼠分别在感染后5～7d和9～12d均100％死亡;而WH6和PRU株对BALB/c小鼠和昆明鼠的毒性均较弱,两种小鼠在感染后45d均100％存活,且在脑内检出包囊.棒状体蛋白家族毒力相关分子ROP5和ROP18的氨基酸序列分析发现,Chinese 1型虫株WH3和Wh6与PRU型虫株(Ⅱ型虫株)差异较小,而与毒力较强的RH型虫株(Ⅰ型虫株)差异较大.结论 我国流行优势基因型弓形虫株的毒力相关分子ROP5和ROP18,与传统Ⅰ型、Ⅱ型弓形虫株存在差异,为我国弓形虫病的防治提供理论基础.
