首页 > 文献资料
-
活化STAT蛋白抑制剂1调控巨噬细胞迁移能力及机制的实验研究
目的:通过绿色荧光蛋白标记巨噬细胞的转基因斑马鱼(Lyz-EGFP)实时观察活化STAT蛋白抑制剂1(protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1)与巨噬细胞间的关系,揭示其作用的相关机制,从而为PIAS1参与炎性疾病的基础研究提供依据.方法:以PCSⅡ质粒为基础,体外构建Morpholino-PIAS1验证质粒PIAS1(213bp)-GFP、PIAS1-mRNA表达质粒并体外表达mRNA,并以随机错配5个碱基的错配(Mismatch)作为阴性对照.培养野生型斑马鱼和Lyz-EGFP转基因斑马鱼,利用显微注射技术,将Morpholino-PIAS1+PIAS1(213bp)-GFP-mRNA、PIAS1(213bp)-GFP-mRNA+Mismatch分别共注射单细胞期野生型斑马鱼胚胎,作为Morpholino组及Mismatch阴性对照组,发育6 h后在荧光显微镜下观察荧光表达变化,确定敲减和高表达靶向基因的效率和特异性.然后将Morpholino-PIAS1、PIAS1-mRNA、Mismatch组分别或共同注射单细胞期斑马鱼胚胎,发育60 h后行无菌手术刀斑马鱼切尾,采用共聚焦显微镜,实时动态观察在炎症区域巨噬细胞向伤口处迁移现象及计数,采用蛋白印迹法检测ERK/JNK/p38MAPK/MMPs信号转导通路蛋白的表达情况.结果:单细胞胚胎期观察6 h后发现,Morpholino-PIAS1注射组野生型斑马鱼胚胎可见绿色荧光的减灭,而Mismatch阴性对照组无改变,组间红色荧光无差异.Lyz-EGFP转基因斑马鱼胚胎发育60 h尾巴切除6 h后见Morpholino-PIAS1注射组绿色荧光细胞向尾部迁移增加,而PIAS1-GFP-mRNA注射组绿色荧光细胞向尾部迁移减少,拯救实组(Rescure)组(Morpholino-PIAS1+PIAS1-mRNA共同注射)引起荧光细胞的迁移增加有所减少,差异有统计学意义(P<0.05).蛋白印迹检测结果显示,Morpholino-PIAS1注射组、Rescure组及Mismatch阴性对照组的ERK、JNK、p38MAPK总蛋白及磷酸化水平及MMP-9蛋白表达升高,TIMP-1蛋白表达下降;而PIAS1-mRNA注射组的ERK、JNK及p38MAPK磷酸化蛋白水平下降,随后MMP-9蛋白水平下降,TIMP-1蛋白水平升高,与Morpholino-PIAS1组、Rescure组及Mismatch阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:PIAS1对巨噬细胞活化迁移具有抑制作用,其机制涉及PIAS1调控ERK/JNK/p38MAPK/MMPs信号转导途径.通过上调PIAS1的表达,可抑制巨噬细胞等炎症细胞活化、迁移,进而改善炎性疾病的严重程度.
关键词： 活化STAT蛋白抑制剂-1 巨噬细胞 炎症 斑马鱼
