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HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的构建与表达
采用RT-PCR技术从HLA-A*0206和-A*0207阳性个体的PBMC中分别克隆出HLA-A*0206和-A*0207基因的全长cDNA序列,构建HLA-A*0206和-A*0207克隆载体.再利用PCR技术从构建的克隆载体中扩增HLA-A*0206和-A*0207的α链(重链)胞外段序列,分别经双酶切置换本室保存的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使HLA-A*0206和-A*0207与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)序列融合,构建HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的表达载体,经限制性酶切和DNA测序证实.然后将该表达载体转化E.coli BL21(DE3)后获得表达产物,通过体外稀释复性,初步纯化的表达产物通过ELISA和Western blot检测证明能够与β2微球蛋白(HLA I类分子轻链)及HLA-A2限制性抗原肽(HBV core 18-27)折叠形成具有HLA I类分子天然构象的抗原肽/HLA-A2复合物单体.为进一步构建HLA-A*0206和-A*0207四聚体,探讨相应HLA-A2亚型的功能特点提供了物质基础.
关键词： 克隆 HLA-A*0206和-A*0207 生物素化序列 -
sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究
本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达.表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Western blot和夹心ELISA法鉴定.证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性.为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHC I类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础.
关键词： sHLA-A*2402 生物素化序列 稀释复性 -
可生物素化HLA-A2-生物素化序列融合基因的构建与表达
本文采用RT-PCR技术从人外周血PBMC中克隆HLA-A2基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列后,装入pET-42b(+)高效表达载体进行诱导表达.并对表达产物进行纯化与复性.结果成功地扩增出HLA-A2基因并测序证实;构建了融合表达载体pET-HLA-A2,并获表达与纯化.为研究在原核系统中表达、纯化与复性及进一步体外构建MHC-I类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础.
