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简单节杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究
目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质.方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21 (DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化.结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27％;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y.突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致.结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础.
关键词： 3-甾酮-△1-脱氢酶 简单节杆菌 同源建模 定点突变 -
微生物3-甾酮-△1-脱氢酶的研究进展
3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDH)属于黄素蛋白酶类,位于细胞膜上,能在3-甾酮化合物的C1和C2之间引入双键,提高原有底物的抗炎活性,在甾体药物的生产上发挥着重要作用.文章对已报道的不同微生物来源的KSDH进行比较分析,着重介绍了关于KSDH基因表达和敲除方面的研究,并对该酶在甾体转化方面的应用做一简要总结.
关键词： 3-甾酮-△1-脱氢酶 表达 敲除 甾体转化
