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大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化
目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.
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骨桥蛋白缓解大鼠SAH后脑血管痉挛的抗炎机制研究
目的 探究重组骨桥蛋白(r-OPN)的抗炎机制对缓解蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的作用.方法 将48只大鼠随机分为假手术+安慰剂组(n=12)、SAH+安慰剂组(n=12)、SAH+r-OPN 0.03(0.03 μg)组(n=12)和SAH+r-OPN 0.1(0.1 μg)组(n=12).采用枕大池二次注血法建立SAH模型.首次注血后72 h取脑脊液,处死大鼠,苏木精-伊红(HE)染色后测量基底动脉横截面积和管壁厚度,判断脑血管痉挛情况,Western blot测定基底动脉磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)水平,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)水平.结果 与SAH+安慰剂组相比,SAH+r-OPN 0.1组大鼠基底动脉横截面积明显增加,管壁厚度明显减轻,基底动脉p-JNK表达明显降低,脑脊液TNF-α、IL-1β水平明显降低.结论 r-OPN能有效缓解SAH后CVS,其机制可能与降低p-JNK的表达,从而抑制TNF-α及IL-1β的产生,抑制SAH后的炎症反应有关.
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骨桥蛋白对大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的作用
目的：探究重组骨桥蛋白（ r-OPN）对蛛网膜下腔出血（ SAH）后脑血管痉挛（ CVS）的作用及其可能机制。方法将48只大鼠随机分为假手术＋安慰剂组、SAH＋安慰剂组、SAH＋低剂量r-OPN组和SAH＋高剂量r-OPN组。采用枕大池二次注血法建立SAH模型。首次注血后72 h取脑脊液，处死大鼠，通过测量基底动脉横截面积和管壁厚度判断脑血管痉挛情况，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测脑脊液中内皮素-1（ET-1）水平， Western blot测定基底动脉磷酸化内皮型一氧化氮合酶（ p-eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（ iNOS）水平。结果与SAH＋安慰剂组相比，SAH＋高剂量r-OPN组大鼠基底动脉横截面积明显增加，管壁厚度明显减轻，脑脊液ET-1水平明显降低，基底动脉p-eNOS表达明显升高，iNOS表达明显降低。结论 r-OPN能有效缓解SAH后CVS，其机制可能与抑制ET-1的产生、降低iNOS的表达，提高p-eNOS的表达有关。
