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人LN α4链LG3-4组件的优化表达及活性检测
目的优化人层粘连蛋白α4链LG3-4组件基因在大肠杆菌中的表达条件.方法分别从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度等方面进行优化.表达产物经Ni-NTA介质纯化,MTT法检测目的蛋白对人肺癌A549细胞粘附及增殖功能的影响.结果在20℃下,1 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白呈佳可溶性表达;在37℃下,2 mmol/L的IPTG诱导4 h,呈佳包涵体形式表达.纯化后目的蛋白纯度达96%,且具有良好的增强人肺癌A549细胞伸展和粘附的功能.结论已确立了hLNα4LG3-4重组蛋白在大肠杆菌中的佳表达条件.
关键词： hLNα4LG3-4 基因表达 活性 -
人层粘连蛋白α4链LG3-4组件的克隆和表达
目的利用基因工程技术获得重组人层粘连蛋白α4链LG3-4组件(human laminin Alpha4 LG3-4 Module, hLNα4LG3-4)蛋白并检测其抗原性.方法采用RT-PCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG3-4的cDNA片段,T/A克隆法将其插入pMD-18T载体进行测序.亚克隆法构建原核表达载体pET-28a-LG3-4,在BL21(DE3)中表达hLNα4LG3-4融合蛋白.融合蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析.结果成功获得hLNα4LG3-4 cDNA片段,与GenBank中序列同源性为98%,突变碱基不改变蛋白的氨基酸序列.12%SDS-PAGE电泳检测显示:经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET28a-LG3-4细菌裂解液总蛋白中出现一条分子量为44×103的新蛋白带,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,且Western印迹可特异地检测到目的蛋白所对应转移带.结论成功表达和纯化了hLNα4LG3-4蛋白,从而为研究LG组件在疾病发生过程中的作用及其功能位点打下了基础.
关键词： hLNα4LG3-4 克隆 表达
