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以乙肝病毒核心蛋白为载体制备肠道病毒71型非结构蛋白3D单克隆抗体
目的:预测肠道病毒71型(EV71)非结构蛋白3D的表位,以HBc蛋白为载体展示多肽,制备并鉴定抗EV71-3D的特异性单克隆抗体(mAb).方法:应用生物信息学方法分析预测出EV71 3D蛋白亲水性和免疫原性指数较高的多肽片段,并运用HBc颗粒型蛋白载体展示肽段,构建多肽融合蛋白,免疫BALB/c雌鼠,通过杂交瘤技术和亲和层析技术制备和纯化抗EV71-3D蛋白的特异性mAb,用间接ELISA、ELISPOT、IFA和IHC对mAb的性质进行初步鉴定.结果:构建表达分别嵌合3D蛋白34～43位氨基酸残基、 61～76位氨基酸残基、151～164位氨基酸残基的HBc重组蛋白,免疫并经过多轮克隆化筛选,获得抗EV71-3D单克隆抗体3E1,其亚类为IgG2a;免疫荧光试验、ELISPOT法和免疫组织化学染色结果显示其可与EV71特异性结合.结论:成功制备可特异性识别EV71的单克隆抗体3E1,为病毒的检测及进一步研究3D蛋白的功能奠定了基础,同时还验证了生物信息学技术与HBc颗粒型载体展示多肽技术相结合可快速高效地制备单克隆抗体.
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带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的 构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签(HA标签)的乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBc)的表达质粒,为进一步研究HBc蛋白基因的功能奠定实验基础.方法 设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563 bp;PCR产物经过EcoRI和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3/HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48 h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达.结果 纯化质粒的相对分子质量为5.9 kb,酶切鉴定结果符合目的条带(563 bp)大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28 kDa.结论 成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3/HA-HBc蛋白, 为进一步研究HBc蛋白的功能奠定了良好的实验基础.
