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激活态许旺细胞在胶原几丁糖膜上的生长规律
背景:新型组织工程材料和许旺细胞扩增后置入生物合成管内去修复周围神经的缺损,是人工生物材料管的两大进展.目的:以胶原几丁糖为支架,以激活态的许旺细胞为种子细胞,观察二者的亲和性以及激活态的许旺细胞在胶原几丁糖膜上的生长规律,为人工神经的预构做准备.设计:开放性实验.单位:复旦大学附属华山医院手外科.材料:实验于2003-07/2003-12在卫生部手功能重建重点实验室完成.选取清洁级雄性SD大鼠4只.胶原几丁糖膜(上海其胜生物材料技术研究所提供),许旺细胞激活液(自制).方法:大鼠麻醉后坐骨神经切断预变性7 d,再次麻醉后引颈处死,迅速切取双侧坐骨神经,置于含青霉素和链霉素的D-HANK'S液中,剔除神经外膜,剪碎成1 mm的小段,移入盛有质量浓度为5g/L的胰蛋白酶和0.6g/L的胶原酶的离心管中,每2 mL液体中加入激活液0.5 mL,复合酶分步消化法获激活态许旺细胞,以浓度为2×107 L-1激活态的许旺细胞200 μL接种于胶原几丁糖膜上和培养皿上,2周后通过相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长情况,S-100染色鉴定细胞的纯化程度.主要观察指标:①绘制细胞生长曲线,确定体外倍增时间.②激活态许旺细胞倒置相差显微镜下观察结果.③激活态许旺细胞接种于胶原几丁糖膜上扫描电镜观察结果.结果:①体外倍增时间的确定:激活态的许旺细胞接种于胶原几丁糖膜和培养皿上时的浓度均是2×107 L-1,2周后细胞浓度分别达到30×107 L-1和20×107 L-1.根据DT=(t-t0)lg2/(lgn-lgn0)算出激活态许旺细胞在胶原几丁糖膜上的倍增时间为4 d.②激活态许旺细胞倒置相差显微镜下观察结果:接种于培养皿上的激活态许旺细胞24 h后大多数由圆球形变成长梭形,有突起,多为双极,也有的呈三极状;接种于膜上的激活态许旺外形上和培养皿中无明显差异,但膜上的激活态许旺细胞在相差显微镜下犹如"刻在沙地上的文字"一般.S-100染色见激活态许旺细胞成棕色,纯度达95%以上.③激活态许旺细胞接种于胶原几丁糖膜上扫描电镜观察结果:激活态许旺细胞多数生长于胶原几丁糖膜的凹陷中或紧贴膜表面,呈有规律的首尾相接贴附于膜上,胞体呈纺锤形,直径在4～6 μm,长度为60～80 μm,细胞呈梭形,有许多细小分枝.1周时膜的形态仍然完整.结论:胶原几丁糖膜和高度纯化的激活态许旺细胞有良好的亲和性,以其为工艺材料制成的组织工程支架很有可能在促进周围神经再生中发挥优势作用.
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许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致神经元死亡的干预
背景:许旺细胞源神经营养因子是从许旺细胞胞浆中分离纯化出的一种相对分子质量为58000的神经营养物质,具有明显的神经营养活性,能对抗一氧化氮神经毒性物质.目的:建立根性撕脱伤动物模型,观察许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致脊髓前角运动神经元死亡的保护作用.设计:重复观察测量.单位:深圳市第二人民医院骨三科,中山大学附属第一医院显微外科.材料:实验于2003-03/05在中山大学医学院实验动物中心完成.选用清洁级3～4月龄SD大鼠20只,随机分为许旺细胞源神经营养因子组、生理盐水对照组,各10只.两组动物均以左侧为正常侧,右侧为损伤侧.方法:①两组大鼠均建立颈6,7神经根性撕脱伤动物模型.②许旺细胞源神经营养因子组将一小块预浸有质量浓度为1g/L的许旺细胞源神经营养因子40μL的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面,生理盐水对照组将一小块预浸有等量生理盐水的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面.③明胶海绵表面置硅胶管,硅胶管一端与明胶海绵缝扎,另一端用凡士林封闭固定于皮下,关闭切口后伤口局部肌肉注射青霉素预防感染.术后两组动物分别通过硅胶管定期注射许旺细胞源神经营养因子或生理盐水20 μL,1次/周,3周后取材.④切取颈6,7脊髓节段,观察损伤侧脊髓前角运动神经元的存活率和形态学变化以及一氧化氮合酶的表达.主要观察指标:①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化.②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化.结果:实验选用20只大鼠,全部进入结果分析.①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化:颈6,7神经根性撕脱术后3周,生理盐水对照组损伤侧68.6%的运动神经元死亡,存活率31.4%,明显低于正常侧(P＜0.01),且存活的神经元胞体严重萎缩;许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元的死亡率较生理盐水对照组减少35%(P＜0.01),存活率为66.4%,且存活的神经元胞体代偿性增大,基本与正常侧相似(P＞0.05).②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化:正常情况下,脊髓中的一氧化氮合酶阳性神经元主要见于后角浅层,中央导水管周围、中间外侧柱和脊髓背根神经节中的内脏传入神经元,前角运动神经元不表达一氧化氮合酶.颈6,7神经根性撕脱术后3周,生理盐水对照组损伤侧脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达明显增多,而其正常侧和许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元均未见一氧化氮合酶表达增加.结论:脊神经根性撕脱可引起脊髓前角运动神经元的死亡和一氧化氮合酶表达,许旺细胞源神经营养因子则对受损的神经元有明显的保护作用和抑制一氧化氮合酶表达.提示许旺细胞源神经营养因子的神经元保护作用可能是通过改变神经元的一些细胞分子例如一氧化氮合酶而实现的.
