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双重消减纯化体外培养许旺细胞
背景:许旺细胞培养技术和纯化方法虽不断改良,得到的培养物纯度仍然有限,双重消减法是否可以培养高纯度许旺细胞.目的:采用双重消减法对许旺细胞进行培养,观察其生长情况并测定培养纯度.设计:对照动物实验.单位:首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科,北京市耳鼻咽喉科研究所.材料:实验于2006-03/07在北京市耳鼻咽喉科研究所免疫室和病理室完成.选用20只3天龄Wistar大鼠,雌雄不限,由中国医学科学院实验动物中心提供.方法:分离大鼠坐骨神经,以0.2%胶原酶消化后培养.①分组干预:细胞分为实验组及对照1,2,3组,每组5只.实验组应用双30 min差速贴壁法和Ara-c纯化,对照组1,2分别用双30 min差速贴壁法和Ara-c纯化处理,对照组3不进行纯化.②实验评估:倒置显微镜下观察许旺细胞生长情况;采用MTT法测量实验组和对照组3生长曲线,观察细胞增殖能力;采用免疫细胞化学染色对许旺细胞进行鉴定;计算许旺细胞培养纯度(每个视野S100阳性细胞占所有细胞的比例).主要观察指标:①各组许旺细胞生长情况.②免疫细胞化学染色结果.③细胞生长曲线.④许旺细胞培养纯度.结果:①许旺细胞生长情况:培养5 d时实验组许旺细胞形态及增殖能力良好,偶见成纤维细胞.对照组1、2在培养第5天时可见较多成纤维细胞,许旺细胞形态好,但较少呈漩涡状排列的生长区域.对照组3从培养第2天开始成纤维细胞迅速增殖,所占比例逐渐增大,许旺细胞生长受到影响,突起较短,少见漩涡状生长区域.②许旺细胞生长曲线:实验组许旺细胞于第3天进入对数增殖期,至第6天达平台期.对照组3较实验组提前1 d进入对数增殖期.③免疫细胞化学鉴定结果:实验组经抗S100抗体染色,阳性的许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,梭形或三角形,双极突起,漩涡状排列.成纤维细胞形态不规则,胞浆宽大,着蓝色.④许旺细胞计数:实验组S100阳性细胞所占比例高于对照组3(P＜0.01).结论:利用双重消减法得到较高纯度的许旺细胞培养物.
