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利妥昔单克隆抗体和地塞米松联合环磷酰胺治疗复发难治的免疫性血小板减少症
目的:评估利妥昔单克隆抗体和地塞米松联合环磷酰胺治疗复发难治的免疫性血小板减少症(ITP)的有效性、安全性及其可能的作用机制.方法:前瞻性纳入12例复发难治的ITP患者,给予利妥昔单克隆抗体375 mg/m2,每周1次,连用4周;地塞米松40 mg,连用4d,环磷酰胺500 mg/m2,两周1次,连用2周.用ELISA法检测患者治疗前后外周血IFN-r和IL-4水平,流式细胞术检测治疗前后调节性淋巴细胞Breg、Treg和Th17的水平,同时观察治疗前后血小板计数的变化,监测不良反应.结果:12例患者中6例(50.00％)获得完全缓解,4例(33.33％)部分缓解,总有效率为83.33％.治疗前血小板计数的平均值为(12.83 ±6.01)×109/L,治疗后血小板的平均峰值为(115.42 ±76.60)×109/L,二者差异有显著统计学意义(P ＜0.001).治疗后IFN-r/ IL-4比值(5.89±2.30)较治疗前(7.00±2.73)下降,差异均有显著统计学意义(P=0.002).治疗后外周血Breg细胞(21.27±4.28)％较治疗前(15.48±1.67)％升高(P ＜0.001),Treg/Th17比值(3.07±1.50)较治疗前(0.98±0.45)升高(P ＜0.001),差异均有显著统计学意义.不良反应为输液反应(1例),继发性高血压和高血糖(1例),呼吸道感染(2例).结论:利妥昔单克隆抗体和地塞米松联合环磷酰胺可改善复发难治ITP患者的疗效,且患者耐受性较好,其机制可能为促使辅助T细胞亚群及调节性淋巴细胞达到平衡.
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人脐带间充质干细胞来源外泌体对Treg和TH17细胞的调节作用
目的:探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体对Treg和TH17细胞的影响.方法:应用超高速离心法获取脐带间充质干细胞培养上清来源的外泌体,通过电子显微镜检、Nanosight和Western blot方法对外泌体形态、粒径和所含蛋白进行鉴定.在外周血单个核细胞(PBMC)的培养体系中,以外泌体共培养为实验组,PBS组为对照组,应用流式细胞术检测实验组与对照组Treg及TH17细胞比例.结果:人脐带间充质干细胞来源的外泌体在电子显微镜下呈杯状圆盘形,平均粒径142 nm,表达外泌体标志性蛋白CD9及CD63.流式细胞术结果显示,外泌体组Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞比例明显高于无外泌体组(5.30±0.13％ vs 3.38±0.09％)(P＜ 0.001),而外泌体组TH17(CD4+IL17A+)细胞比例明显低于无外泌体组(7.78±0.31％ vs 11.33±0.24％)(P＜ 0.001).结论:人脐带间充质干细胞来源的外泌体能通过上调Treg和下调TH17参与免疫调节,提示有望成为新的“非细胞”免疫调节制剂.
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CD4+CD25high T细胞在特发性血小板减少性紫癜发病机制中的作用
本研究探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)治疗前后患者外周血中CD4+ CD25highT细胞(CD25-PE染色阳性＞102为CD4+ CD25highT细胞)的表达情况及其可能的作用机制.应用免疫荧光标记和流式细胞术检测20例治疗前ITP患者、20例治疗后患者及14名正常人外周血中CD4+ CD25highT细胞的表达.结果表明:ITP患者治疗前外周血T细胞表面CD4+ CD25highT细胞表达水平明显低于治疗后组及正常对照组(P均＜0.01);ITP治疗后患者组与正常对照组相比无显著性差异(P＞0.05).结论:ITP治疗前患者外周血中CD4+ CD25highT细胞水平较正常对照组明显降低,而在治疗有效后有所升高.外周血CD4+ CD25highT细胞表达率与血小板数量呈正相关.CD4+ CD25highT细胞水平的检测可作为对ITP患者预后判断的一个有效指标,并可以作为免疫治疗的靶点进行进一步研究.
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骨髓增生异常综合征患者血清白介素-35表达水平及其诱导产生的新型调节性T细胞iTR35比例和临床意义
目的:探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者血清新型免疫抑制因子——IL-35表达水平及其诱导产生的新型调节性T细胞iTR35的临床意义.方法:选取2014年1月至2016年1月福建省泉州市第一医院血液科收治的23例初诊MDS患者为研究对象,根据MDS国际预后积分系统(IPSS)将其分为高危(n=4),中危-2(n=10),中危-1(n=5)和低危型(n=4)4个亚组.选取同期在我院体检的20例正常人为正常对照组.分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术(FCM)检测各亚组患者血清IL-35表达水平及iTR35细胞比例.结果:MDS组患者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞比例显著高于对照组(P＜0.01),iTR35细胞比例高于正常对照(P＜0.01),而两组的CD4+ CD25-Foxp3+ Treg细胞比例无显著的统计学差异(P＞0.05).MDS组的血清IL-35水平显著高于对照组(P＜0.05),Treg细胞内IL-12p35和IL-27EBl3表达水平也较对照组显著上调(P＜0.05),且MDS组的血清IL-35水平与IL-12p35和IL-27EBl3表达水平及iTR35细胞比例呈正相关(r分别为0.92、0.99和0.52,P＜0.05).MDS的4个亚组中,iTR35细胞比例及血清IL-35表达水平总体具有显著性差异(P＜0.05),高危组与中危-2组患者的血清IL-35水平无明显差别(P＞0.05),但两组均分别明显高于中危-1组和低危组(P＜0.05),中危-2组也明显高于中危-1组及低危组(P＜0.05),而中危-1组与低危组无差别(P＞0.05).高危组与中危-2组的iTR35细胞比例无显著差别,但高危组和中危-2组的iTR35细胞比例均显著高于中危1组和低危组(P＜0.05),而中危1组与低危组无明显差别(P＞0.05).结论:IL-35水平和iTR35细胞的数量和(或)功能失衡在MDS发生、发展过程中起着重要作用,有望为MDS免疫靶向治疗研究提供新的理论依据.
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新生儿脐带血调节性T细胞和pDC频数及功能研究
目的 探讨新生儿脐带血中CD4+ CD25+ CD127low调节性T细胞和pDC频数和功能.方法 收集2013年8月至2014年2月在北京地坛医院妇产科分娩的HBV DNA阴性(＜100IU/ml)孕妇所生新生儿脐带血以及正常成人外周静脉血,采用流式细胞仪分析技术测定两组全血样本中CD4+ CD25+ CD127lowTreg细胞占CD4+细胞比率以及pDC频数和表面分子水平;采用Luminex技术分别检测两组血清中细胞因子IFN-a、IFN-r、IL-6、IL-10、IL-17A、Flt-3L水平.结果 新生儿脐带血CD4+ CD25+ CD1271owTreg细胞频数(7.34土1.54)与正常成人组(8.14土1.15)之间差异无统计学意义;新生儿Linl-HLA-DR+CD123+pDC细胞频数及其表面功能分子CD80、CD83和CD86阳性率均显著低于正常成人组(P =0.000),而TLR-9表达阳性率(21.30土22.50)与成人(34.27土11.31)差异无统计学意义;新生儿脐血中细胞因子IFN-r及IL-17A水平显著低于正常成人组(P=0.003,P=0.010),而IFN-a、IL-10、IL-6及Flt-3L水平在两组之间差异无统计学意义.结论 新生儿pDC频数、成熟度低于成人可能与新生儿感染HBV易慢性化有关.
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慢性乙型肝炎患者CD4+T细胞Foxp3基因甲基化状态的研究
目的 研究慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者CD4 +T细胞叉头框转录因子3(forkhead box protein 3,Foxp3)基因的甲基化状态.方法 收集59例CHB患者和22例健康对照者(HC)的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),流式细胞技术检测外周血CD4+T细胞中CD4+ 25+ Foxp3+调节性T细胞(CD4+ 25+ Foxp3+ Tregs)的比例,实时定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测CD4 +T细胞Foxp3基因和蛋白表达水平,甲基化特异性聚合酶链反应检测CD4+T细胞Foxp3基因的甲基化状态.结果 CHB患者CD4+ 25+ Foxp3+ Tregs比例、Foxp3基因mRNA和蛋白表达水平均明显高于HC组(P＜0.05).CHB患者中,Foxp3基因的甲基化率显著低于HC组(P＜0.05),Foxp3基因甲基化组的mRNA表达水平及CD4+ 25+ Foxp3+ Tregs比例均显著低于未甲基化组(P＜0.05).结论 CHB患者CD4 +T细胞中Foxp3基因存在异常去甲基化,与慢性乙型肝炎的免疫机制有关.
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体外诱导的Helios+调节性T细胞的特征分析
目的 本研究拟对体外诱导的Helios+调节性T细胞(induced Helios+regulatory T cell, Helios+iTreg)的特征进行分析,并比较其与正常人外周血固有Helios+Treg(natural Helios+Treg, Helios+nTreg)的差异.方法 采集并分选正常人外周CD4+CD25-效应性T细胞(effector T cell,Teff),体外以抗CD3/抗CD28合并IL-2及TGF-β刺激诱导Helios+iTreg生成,以外周血Helios+nTreg作为对照,通过流式细胞术和real-time PCR分别分析其表型特征Foxp3+Treg特异性去甲基化区(Treg-specific demethylated region,TSDR)的甲基化水平.结果 体外诱导的Helios+iTreg高表达CD45RA,而Helios+nTreg几乎不表达CD45RA;体外诱导的Helios+iTreg较Helios+nTreg CD127、ICOS和PD-1的水平明显升高,IL-2和IFN-γ的表达水平明显升高,但CXCR3、CCR4等趋化因子受体的水平则明显下降;另外CD25的表达水平也明显下降;诱导型Helios+iTreg TSDR的甲基化水平明显低于Helios+nTreg.结论 诱导型Helios+iTreg具有与Helios+nTreg不同的特征,提示其在生理及病理条件下可能发挥不同的免疫调节作用.
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急性期川崎病患者p300-TIP60/Sirt1与Foxp3蛋白乙酰化的相关性研究
目的：探讨p300-TIP60/Sirt1对急性期川崎病( KD) Foxp3蛋白乙酰化的影响及其在KD免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿38例,正常同年龄对照组32例,KD患儿分别于丙种球蛋白( IVIG)治疗前、后直接取血备检。采用免疫共沉淀-印迹法检测外周血CD4+T细胞Foxp3蛋白乙酰化及p300、TIP60和Sirt1结合水平；流式细胞术检测外周血CD4+CD25highFoxp3+细胞(Treg)比例及Foxp3、pAMPK、p300、TIP60、Sirt1蛋白表达水平；实时荧光定量PCR检测Treg细胞细胞毒T淋巴细胞相关抗原4( CTLA-4)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体( GITR )、IL-10、肝激酶 B1(LKB1)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)、早期生长应答因子-1(EGR-1)、转化生长因子β受体-1(TGF-βRⅠ) mRNA表达；ELISA检测外周血血浆中TGF-β浓度。结果(1)急性期KD患儿Treg细胞比例、抑制功能相关分子表达( CTLA-4、GITR、IL-10)、Foxp3蛋白及乙酰化水平显著降低( P<0.05),其中KD合并冠状动脉损伤组(KD-CAL+)前述各项均低于无冠状动脉损伤组(KD-CAL-,P<0.05),经IVIG治疗后明显恢复(P<0.05)。(2)急性期KD患儿Treg细胞乙酰化酶p300、TIP60表达及Foxp3结合水平显著下调(P<0.05),而去乙酰化酶 Sirt1表达及 Foxp3结合水平明显增加(P<0.05),且p300/Sirt1、TIP60/Sirt1表达比值与Foxp3蛋白乙酰化水平呈正相关关系(r=0.52、0.46； P<0.05),经IVIG治疗后均明显恢复(P<0.05)。其中KD-CAL+组p300、TIP60表达及Foxp3结合水平明显低于KD-CAL-组(P<0.05),而Sirt1表达及Foxp3结合水平则明显高于后者(P<0.05)。(3)急性期KD患儿血浆TGF-β及Treg细胞TGF-βRⅠ、EGR-1表达显著下调(P<0.05),而LKB1、pAMPK、NAMPT表达明显增加(P<0.05),其中KD-CAL+组前3项明显低于KD-CAL-组(P<0.05),而LKB1、pAMPK、NAMPT表达明显高于KD-CAL-组(P<0.05),经IVIG治疗后均有不同程度恢复(P<0.05)。结论 p300-TIP60/Sirt1表达失衡所导致的Foxp3蛋白乙酰化水平低下可能与急性期KD患儿免疫功能紊乱有关。
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白细胞介素-35调控CD4+CD25+CD127 dim/-调节性T细胞在呼吸机相关性肺炎发病中的作用
目的 观察呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)患者外周血和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中CD4+CD25+CD127dim/-调节性T细胞(regulato-ry T cells,Tregs)和白细胞介素(interleukin,IL)-35的变化,并分析IL-35对Tregs的调控在VAP发病中的作用.方法 收集23例VAP患者和11例健康志愿者(normal controls,NCs),分离外周血单个核细胞、血清和BALF,通过酶联免疫吸附试验检测IL-35水平,通过流式细胞术检测CD4+CD25+CD127dim/-Tregs比例.纯化BALF中CD4+CD25+CD127dim/-Tregs,利用重组人IL-35对纯化的Tregs刺激培养后与自体CD4+CD25-T细胞共培养,检测细胞增殖和分泌细胞因子水平.结果 外周血中Tregs的比例和血清IL-35水平在VAP患者和NCs之间差异无统计学意义.但在VAP患者中,感染部位BALF中Tregs的比例和IL-35水平较非感染部位显著升高,且BALF中Tregs的比例与IL-35水平呈显著正相关(r=0.441,P=0.035).经抗感染等综合治疗后,病情好转的患者BALF中Tregs的比例和IL-35水平较治疗前显著下降,Tregs分泌IL-35的水平亦显著下降,但病情未好转或恶化的患者BALF中Tregs的比例和IL-35水平与治疗前比较则无明显变化,Tregs分泌IL-35的水平亦无明显变化.同时,病情好转患者Tregs抑制细胞增殖能力和分泌IL-10水平均较病情未好转或恶化患者减弱.利用重组人IL-35刺激治疗前患者BALF中纯化的Tregs可增强其免疫抑制功能,主要表现为细胞增殖减弱、抑制性细胞因子(IL-35和IL-10)分泌增多以及促炎因子(IFN-γ和TNF-α)分泌减少,但是,IL-35对治疗好转患者BALF中纯化Tregs的功能无显著影响.结论 IL-35和Tregs在VAP患者BALF中显著升高,且IL-35可增强Tregs的免疫抑制功能.IL-35调控Tregs功能可能参与了VAP的发病.
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前列环素类似物对调节性T细胞分化的调节作用及机制
目的 探讨前列环素(PGI2)类似物伊洛前列素(Iloprost)对调节性T细胞(regulatoryT cells,Treg)分化的调节作用及其信号机制.方法 采用免疫磁珠分选人外周血初始CD4+ T细胞,体外诱导其向Treg细胞分化,使用流式细胞术、RT-PCR方法分别从Treg细胞频率和Foxp3 mRNA表达2个方面探讨Iloprost对Treg细胞分化的调节作用及其受体机制.之后,使用免疫荧光法测定胞内cAMP含量,流式细胞术检测胞内STAT5磷酸化水平,以探索Iloprost调节Treg细胞分化的信号通路.结果 Iloprost剂量依赖性地降低了Treg细胞频率和Foxp3 mRNA表达(P＜0.05),而IP受体被受体阻断剂(CAY 10449)阻断之后,Iloprost的上述抑制作用大幅回升.Iloprost可上调Treg细胞胞内cAMP水平(P＜0.05),其对Treg细胞分化的调节作用能被cAMP激动剂db-cAMP模拟(P＞0.05),且被蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89所逆转.另外,Iloprost可下调IL-2诱导的STAT5磷酸化(P＜0.05).同时,db-cAMP模拟了Iloprost对pSTAT5的调节作用(P＞0.05),而该作用被H-89抑制.结论 Iloprost通过与IP受体结合,活化cAMP-PKA信号通路,从而下调pSTAT5水平,进而抑制CD4+ T细胞向Treg分化.
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TGF-β1诱导的调节性T细胞体内输注延长小鼠皮肤移植物存活
目的 利用TGF-β1体外诱导naYve T细胞分化为凋节性T细胞(Treg),通过体内输注延长小鼠皮肤移植物存活时间,并研究其相关机制. 方法 根据诱导条件不同分为3组:对照组(加入IL-2培养的C57BL/6小鼠T细胞)、MLR组(即混合淋巴细胞反应组,经同种抗原刺激活化的C57BL/6小鼠T细胞)和TGF-β组(经同种抗原刺激活化的C57BL/6小鼠T细胞,同时加入5.0ng/ml TGF-β1诱导).利用FACS检测CD4+CD25+T细胞比例,并用RT-PCR检测Foxp3的表达水平.建立小鼠皮肤移植模型,并于第0、l、2和3天输注上述细胞,观察皮肤移植物存活时间.术后第9天,取部分受鼠行移植物病理检测,用FACS检测脾脏中THl、TH2和CD4+CD25+Treg比例,并用Alamar Blue法检测淋巴细胞增殖能力. 结果 TGF-β组中CD4+CD25+T细胞比例高于对照组和MLR组(P<0.05),且其高表达Foxp3.将培养的细胞输注给受鼠后发现,输注MLR组细胞的受鼠其移植物平均存活时间(mean survival time,MST)为(9.4±1.3)d,低于对照组(P<0.05);而输注TGF-13组细胞小鼠MST为(22.8±1.9)d,较对照组和MLR组明显延长(P<0.05).病理检测亦显示TGF-β组受鼠移植物结构完整,无明显淋巴细胞浸润.FACS结果显示TGF-β组小鼠体内TH1细胞(CD4+TIM-3+)比例低于对照组和MLR组(P
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急性期川崎病 Foxp3蛋白泛素化改变及意义
目的：探讨急性期川崎病（ KD） Foxp3蛋白泛素化水平及其在KD免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿48例，正常同年龄对照组28例，KD患儿分别于丙种球蛋白（ IVIG）治疗前、后直接取血备检。采用免疫共沉淀-印迹法检测外周血CD4细胞Foxp3蛋白泛素化水平；流式细胞术检测 CD4＋CD25high Foxp3＋细胞（ Treg）比例及 IL-10、TGF-β、CTLA4、STUB1、HSP70、USP7、pSTAT3蛋白表达水平；实时荧光定量PCR检测CD4＋T细胞IL-1R1、IL-1RAP、IL-6Rα、gp130、TNFR1、MyD88、RIP1 mRNA表达；ELISA检测血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度。结果（1）急性期KD患儿Treg细胞比例及IL-10、TGF-β、CTLA4、Foxp3蛋白表达水平显著降低（P＜0．05），Foxp3蛋白泛素化水平明显高于对照组[（0．52±0．19） vs （0．08±0．02），P＜0．05]，其中KD合并冠状动脉损伤组（KD-CAL＋）前述5项均低于无冠状动脉损伤组（KD-CAL－）（P＜0．05），Foxp3蛋白泛素化水平则高于后者[（0．70±0．28） vs （0．43±0．17），P＜0．05]，经IVIG治疗后均明显恢复[Ubi-Foxp3：（0．24±0．10） vs （0．52±0．19），P＜0．05]。（2）急性期KD患儿CD4＋T细胞STUB1、HSP70表达显著上调（P＜0．05）， USP7表达明显低于正常对照组（P＜0．05），其中STUB1／USP7二者比值显著增高且与其Foxp3蛋白表达呈负相关关系（r＝－0．56， P＜0．05），经IVIG治疗后均明显恢复（P＜0．05）。其中KD-CAL＋组STUB1、HSP70表达及STUB1／USP7比值均高于KD-CAL－组（P＜0．05），而USP7表达则明显低于后者（P＜0．05）。（3）急性期KD患儿血浆IL-1β、IL-6、TNF-α浓度及CD4＋T细胞IL-1R1／IL-1RAP／TLR4／MyD88、IL-6Rα／gp130／pSTAT3、TNFR1／RIP1表达均显著上调（P＜0．05），其中KD-CAL＋组前述各项均高于KD-CAL－组（P＜0．05），经IVIG治疗后明显降低（P＜0．05），其他TLR表达无改变（P＞0．05）。结论 Foxp3蛋白泛素化异常可能与急性期KD患儿免疫调节功能紊乱有关。
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儿童急性B淋巴细胞白血病CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞亚群改变及意义
目的：探讨急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患儿CD4＋CD25highFoxp3＋调节性T细胞（ Treg）亚群改变及其在B-ALL免疫逃逸机制中的作用。方法急性期B-ALL患儿42例，正常同年龄对照组28例，分别于化疗前直接取血备检。采用流式细胞检测外周血CD4＋CD25 high Foxp3＋、CD4＋CD25high ICOS＋Foxp3＋、CD4＋CD25high ICOS-Foxp3＋细胞比例及IL-10、TGF-β、IL-35、TGF-βRII、ICOS、CD28蛋白表达水平；荧光定量PCR （ real-time PCR）检测CD4＋T细胞Smad3/4、TIEG1、Itch等mRNA表达；ELISA检测血浆中TGF-β浓度。结果（1）急性B-ALL患儿CD4＋CD25high Foxp3＋Treg细胞比例显著升高（P＜0．05），其中ICOS＋Foxp3＋和ICOS-Foxp3＋细胞比例均明显高于对照组（P＜0．05）， ICOS＋Foxp3＋/ICOS -Foxp3＋比值低于对照组（0．73±0．21 vs 1．87±0．59，P＜0．05）；（2）急性期B-ALL患儿ICOS＋Foxp3＋细胞转录因子Foxp3及抑制性细胞因子IL-10、IL-35和TGF-β表达水平显著上调（P＜0．05），ICOS-Foxp3＋细胞Foxp3表达略有增加，但差异无统计学意义（P＞0．05），其mTGF-β表达明显高于对照组（ P＜0．05）；（3）急性B-ALL患儿血浆TGF-β浓度明显高于对照组[（25.83±12．65） ng/ml vs （8．59±5．73） ng/ml， P＜0．05]，CD4＋T细胞表面TGF-βRII及下游信号分子Smad3/4、TIEG1、Itch表达水平显著上调（P＜0．05），CD4＋CD25highFoxp3＋Treg细胞表面ICOS、CD28表达亦明显增高（P＜0．05）。结论 TGF-β、ICOS、CD28信号过度活化可能是导致急性B-ALL患儿CD4＋CD25highFoxp3＋Treg细胞异常及其亚群比例失调的重要因素。
关键词： 急性B淋巴细胞白血病 调节性T细胞 FOXP3 ICOS CD28 -
调节性T细胞对输注树突状细胞后小鼠移植心脏的保护作用
目的 探讨在输注供者低表达CD40的树突状细胞(dendritic cells,DC)后,调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)对小鼠移植心脏的保护作用.方法 以针对小鼠CD40基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在体外感染供者骨髓来源的DC,制备低表达CD40的耐受性DC(Tol-DC).建立小鼠异位腹腔心脏移植模型.设置异系对照组、未感染DC组及单纯慢病毒感染DC组.观察各组移植心脏存活时间,评定术后7d移植物排斥反应、病理分级,并以流式细胞术检测手术前后外周血CD4+ CD25+Treg变化水平.结果 CD40-RNAi慢病毒载体在体外感染DC 48 h后,CD40 mRNA表达明显受到抑制,抑制效率为80.9％.CD40表达明显下降,由74.37％ ±4.08％降至40.07％±4.03％ (P＜0.05).与异系对照组和未感染DC组相比,单纯慢病毒感染DC组移植心脏存活时间(14±4)d明显延长(P＜0.01)；术后7d急性排斥反应病理分级均明显降低(P＜0.05)；术后3d、7d外周血CD4+ CD25+ Treg水平均明显升高(P＜0.05).结论 CD4+ CD25+ Treg对输注供者低表达CD40的树突状细胞的小鼠移植心脏具有保护作用.
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宿主的遗传背景对呼吸道感染沙眼衣原体后Treg产生的影响
目的 探讨宿主的遗传背景对呼吸道感染沙眼衣原体后调节性T细胞(Treg)产生的影响.方法 对衣原体感染具有明显易感性差异的C57 BL/6(C57)和C3H/HeN(C3H)小鼠鼻腔吸入1×103 IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm),于感染后不同天数处死小鼠.利用细胞内细胞因子染色技术检测小鼠脾脏单个核细胞CD4+ CD25+T细胞、Foxp3+ CD4+ CD25+T细胞百分率,利用RT-PCR技术检测小鼠肺组织Treg细胞分泌的相关细胞因子IL-10和IL-2的mRNA表达水平,并比较Cm呼吸道感染不同时期C57和C3H小鼠Treg免疫应答水平的差异.结果 Cm感染在两组小鼠均诱导较高水平的CD4+ CD25+T细胞、Foxp3+ CD4+ CD25+T细胞产生及IL-10、IL-2mRNA表达.感染后第3天和第7天,高易感性的C3H小鼠脾脏CD4+ CD25+T细胞、Foxp3+ CD4+CD25+T细胞扩增水平,以及肺组织细胞因子IL-2 mRNA的表达水平均高于C57小鼠,感染后第14天,C3H小鼠IL-10 mRNA表达水平明显高于C57小鼠.结论 衣原体呼吸道感染在高易感性的C3H小鼠诱导高水平的Treg的增殖及Treg相关细胞因子IL-10、IL-2的表达,从而对衣原体特异的Th1免疫应答抑制作用增强,在小鼠衣原体呼吸道感染易感性差异中发挥重要作用.
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人乳头瘤病毒感染宫颈疾病患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞变化研究
目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)感染的宫颈疾病包括宫颈柱状上皮异位(CE)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及宫颈鳞癌(CC)患者外周血中的髓系抑制性细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞17(Th17)的变化规律,以揭示它们在HPV诱导宫颈疾病进展中的作用.方法收集自2011年3月至2016年12月临床检验为HPV阳性的宫颈疾病患者120例(CE患者18例、CIN患者50例、CC患者52例)和HPV阴性患者20例(CE患者10例、CIN患者10例)为研究对象,并以健康志愿者20例为对照.利用流式细胞术检测所有患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量变化,并进行统计分析.结果 HPV阳性宫颈疾病患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量显著高于HPV阴性患者(P<0.05);随着宫颈疾病患者(CE-CINⅠ-CINⅡ-CINⅢ-CC)病理程度的加深,外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量也随之逐渐上升(P<0.05);高危型HPV阳性宫颈疾病患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量显著高于低危型(P<0.05);HPV阳性宫颈癌CC患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞变化与FIGO分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移、血管浸润有关(P<0.05);所有患者治疗后外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量均显著降低(P<0.05),而HPV阳性转阴患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量亦显著降低(P<0.05);HPV阳性宫颈疾病患者外周血中MDSC、Treg、 Th17细胞含量变化呈正相关(r=0.599,0.677,0.648, P均<0.05).结论 HPV阳性患者外周血中MDSC、Treg、Th17细胞含量影响其宫颈疾病病理进程、危险程度、临床病理学特征和治疗疗效,它们可作为检测HPV阳性宫颈疾病发生发展程度的生物指标之一.
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分泌IL-35的Treg细胞对肠道炎症免疫应答的调节作用
目的 研究分泌白细胞介素35(IL-35)的新型效应性调节性T细胞(IL-35-Treg)在肠道免疫应答特别是肠炎反应过程中的调控作用.方法 利用IL-35报告小鼠,通过流式细胞术分析肠道固有层中IL-35-Treg细胞的比例和特征;使用1.5％DSS自由饮水构建小鼠炎症性肠病(IBD)模型,分析剔除IL-35-Treg细胞对小鼠体重、病理损伤和IFN-γ 分泌的影响.结果 发现肠道固有层中占有大比例的IL-35-Treg细胞,该群细胞主要来源于胸腺发育的Treg细胞,并且高表达抑制性分子程序性死亡受体1(PD-1);剔除IL-35-Treg细胞后小鼠体内T细胞分泌大量的IFN-γ,加重了DSS诱导的肠炎发生.结论 IL-35-Treg在肠炎免疫应答中起到重要的调控作用.
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非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠糖尿病发病过程中 B10细胞水平的研究
目的：观察非肥胖性糖尿病（ non-obese diabetic， NOD）小鼠自然病程不同阶段CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞及Th1、Th17细胞数量的变化，探讨B10细胞与NOD小鼠自身免疫性糖尿病发生的关系。方法采用流式细胞术分别检测4周（A组，n＝10）、8周（B组，n＝10）及糖尿病（C组，n＝10）NOD小鼠及同龄C57BL／6小鼠（对照组，n＝20）脾脏、肠系膜淋巴结、外周淋巴结、胰腺淋巴结中CD19＋CD5＋CD1dhigh B、CD19＋IL-10＋B、CD4＋IFN-γ＋Th1、CD4＋IL-17＋Th17细胞及CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞的比例；分离NOD小鼠胰腺组织作病理切片以评估胰岛炎的严重程度。结果（1）胰腺组织HE切片：A组无胰岛炎，4周；B组发生胰岛炎，8周；C组发生明显胰岛炎且无完整胰岛，糖尿病。（2）不同病程阶段NOD小鼠B10细胞比较：B及C组B10细胞较A组增高，而C组B10细胞则较B组显著下降，差异有统计学意义（P＜0．01）；A组B10细胞各组织间无明显差异（P＞0．05），B组B10细胞以胰腺淋巴结高，C组B10细胞以外周淋巴结高且胰腺淋巴结B10细胞较B组显著下降，差异有统计学意义（P＜0．01）。（3）不同病程阶段NOD小鼠效应性T细胞比较：C组Th1及Th17细胞较A、B组显著增加，差异有统计学意义（P＜0．01）。（4）不同病程阶段CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞比较：C组Treg较A、B组无明显变化，且NOD小鼠Treg较同龄C57BL／6小鼠亦无明显变化（ P＞0．05）。结论随NOD小鼠年龄增长及胰岛炎进展，B10细胞存在数量变化及组织分布的差异；B10细胞数量减少可能参与NOD小鼠自身免疫性糖尿病的发生。
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小鼠 B10细胞的分离、鉴定及功能特征
目的：评估小鼠不同组织中B10细胞的比例，分离B10细胞并鉴定其生物学功能，探讨其对效应性T细胞（ CD4＋CD25-T）及调节性T细胞（ Treg）的免疫调节机制。方法采用流式细胞仪检测小鼠不同组织来源B10细胞的表达以及脂多糖（ lipopolysaccharide ，LPS）对B10激活的影响；采用流式细胞分选术（ FACS）和免疫磁珠分选术（ MACS）分选B10细胞、CD4＋CD25-T 细胞和Treg；利用混合淋巴细胞培养实验观察B10对CFSE标记的CD4＋CD25-T细胞和CD4＋CD25＋T细胞增殖的调节作用及机制。结果（1）脾脏CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞表达为（3．95±0．79）％，与外周血、肠系膜淋巴结和外周淋巴结相比较表达高，组间差异有统计学意义（P＜0．05）；脾脏CD19＋IL-10＋B细胞表达为（2．02±0．16）％，与外周血、肠系膜淋巴结和外周淋巴结相比较表达高（P＜0．05），且IL-10主要由CD1dhighCD5＋B细胞亚群分泌（P＜0．01）；（2） LPS联合乙酸佛波醇（PMA）、莫能菌素（monen-sin）和离子霉素（ionomycin）能活化B10细胞分泌IL-10。延长LPS的作用时间（48 h）能促进CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞高表达及IL-10分泌增加（P＜0．01）；（3） CD19＋CD5＋CD1dhigh B细胞在体外可抑制CD4＋CD25-T细胞增殖（P＜0．01）、促进CD4＋T细胞分泌IL-10（P＜0．01），同时可促进Treg增殖（P＜0．01）。结论 B10细胞在小鼠脾脏高表达，通过Toll样受体（TLR）信号通路被激活。活化的B10细胞具有免疫抑制性，可抑制CD4＋CD25-T细胞增殖，促进Treg增殖，其可能免疫调节机制是IL-10的释放增加。因此B10细胞有望为治疗多种自身免疫性疾病提供一种全新的治疗方法。
关键词： 调节性B细胞 IL-10 LPS CD4+CD25-T细胞 调节性T细胞 -
抗原特异性调节性T细胞的诱导及其对动脉粥样硬化的影响
目的 探讨热休克蛋白(HSP)60抗原特异性CD4+CD25+T细胞的体外诱导及其对动脉粥样硬化斑块形成的影响.方法 分离apoE-/-小鼠骨髓单个核细胞,经阿司匹林处理培养出未成熟树突状细胞;体外诱导HSP60特异性调节性T细胞分化,检测其百分比和分泌功能;通过混合淋巴细胞反应研究CD4+CD25+T细胞的特异性抑制效应;过继转移CD4+CD25+T细胞后,观察其对小鼠动脉粥样斑块形成的影响.结果 阿司匹林处理的树突状细胞共刺激分子CD80和CD86表达减少,形态学表现为未成熟树突状细胞;未成熟树突状细胞比成熟树突状细胞能诱导更多的特异性CD4+CD25+T细胞,培养体系中IL-10和TGF-β1水平明显升高.CD4+CD25+T细胞体外明显抑制效应性T细胞的增殖以及IFN-γ的分泌.体内,过继转移HSP60特异性CD4+CD25+T细胞组小鼠动脉粥样斑块面积显著小于对照组.结论 未成熟树突状细胞可诱导出HSP60抗原特异性CD4+CD25+T细胞,后者在体内能明显抑制动脉粥样斑块的形成.
