首页 > 文献资料
-
c血清型变形链球菌致龋相关基因/DNA片段的批量克隆与高通量筛选
目的筛选含致龋相关基因/DNA片段的阳性克隆,为探究变形链球菌致龋的分子机制奠定基础.方法将抑制消减杂交方法获得的高毒力株特异的消减PCR产物与T/A载体pCR2.1连接,将连接产物转化E.coli TOP10F′感受态细胞,进行蓝白筛选.对96个转化子进行Colony PCR,将PCR产物点样于同一尼龙膜上,分别与地高辛标记的变形链球菌高、低毒力株基因组DNA/AluI酶切产物杂交,高通量筛选阳性克隆.结果随机挑取了96个白色或白色中央有蓝色的菌落,经过Colony PCR,其中有1个转化子的扩增产物为双带,其余均为0.2～2kb之间的单一条带.经过杂交,以与高毒力株基因组有杂交信号,而与低毒力株基因组无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆,筛选的阳性率为50%左右,阳性克隆中含有c血清型变形链球菌致龋相关的基因/片段.结论对抑制消减杂交方法获得的变形链球菌高毒力株特异的消减PCR产物进行批量克隆和高通量筛选,获得了致龋相关的基因/DNA片段.
-
不同pH条件下高低致龋性变异链球菌sRNA SpR19及其潜在靶标GroEL的表达变化
目的 研究在不同pH培养条件下,变异链球菌菌株的sRNA SpR19及其潜在靶向的GroEL蛋白在不同致龋力菌株中的表达变化,探讨其作为高致龋变异链球菌的分子鉴别标志物的可能性.方法 提取高致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株17)和低致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株5)的总RNA,建库后进行高通量测序获得差异表达的sRNA;结合生物信息学与文献,挑选关键sRNA与蛋白进行不同致龋菌株表达水平的研究:qRT-PCR验证目的sRNA SpR19在pH5.5和pH7培养条件下不同致龋能力菌株中的表达水平;合成变异链球菌GroEL蛋白抗原多肽并制备多克隆抗体,Western blotting鉴定不同pH培养条件下高、低致龋菌中GroEL的表达水平;qRT-PCR验证不同pH培养条件下不同致龋能力菌株GroEL的mRNA的表达水平.结果 生物信息学提示SpR19可能靶向GroEL的mRNA及上下游基因间区;不同pH条件下,相较于低致龋菌,高致龋菌中sRNA SpR19表达下降(P<0.05),而GroEL蛋白与mRNA高表达(P<0.05),二者表达趋势相反.结论 不同pH条件培养的高致龋性变异链球菌中,sRNA SpR19均低表达,GroEL的蛋白水平与RNA水平均存在高表达,结合生物信息学分析提示sRNA SpR19可能通过靶向GroEL负调控变异链球菌的致龋能力.
