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小窝蛋白-1在脂多糖致肺微血管内皮细胞炎性损伤中的作用探讨
目的 探讨脂多糖(LPS)所致大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)炎性损伤中小窝蛋白-1(Cav-1)的作用机制.方法 将体外培养的RPMVEC,分别进行LPS刺激时效实验和蛋白激酶A(PKA)通路干预实验.①时效实验:以10 μg/mL LPS分别刺激0、1、3、6、12、24h后进行细胞单层通透性(伊文思蓝-白蛋白法)和Cav-1蛋白表达[蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)]检测;并于LPS刺激0、10、30、60、90、120 min检测细胞磷酸化小窝蛋白-1(p-Cav-1)表达(Western blotting).②干预实验:以10μmol/L蛋白激酶A特异抑制剂(PKI)与RPMVEC预孵育30m in后再加入10 μg/mL LPS继续孵育,30 min后检测p-Cav-1表达,3h后检测细胞单层通透性及Cav-1蛋白表达;设未刺激组和LPS或PKI单独刺激组为对照.结果 ①LPS刺激RPMVEC后1 h Cav-1蛋白表达(积分A值)即开始上升(2.97±0.07),3h达峰值(3.77±0.37),之后逐渐下降,但至24 h时(1.45±0.18)仍明显高于LPS刺激0h时(1.12±0.08),组间比较差异有统计学意义(F=178.047,P=0.000);LPS可呈时间依赖性(0、1、3、6、12、24h)增加RPMVEC通透性(A值),变化趋势与Cav-1蛋白表达一致,分别为(99.67±4.32)％、(118.17±2.32)％、(159.00±2.61)％、(141.17±2.64)％、(120.17±2.79)％、(108.83±2.04)％,组间比较差异有统计学意义(F=345.869,P=0.000).LPS亦可呈时间依赖性增加Cav-1磷酸化:10 min时p-Cav-1蛋白表达(积分A值)即开始升高(2.41±0.11),30 min达高峰(2.83±0.10),然后逐渐下降,120 min时(1.04±0.04)恢复到基础水平(1.03±0.04),组间比较差异有统计学意义(F=519.417,P=0.000).②PKI与LPS预孵育可使Cav-1表达(积分A值:5.07±0.22比3.81±0.23,P＜0.01)及p-Cav-1表达(积分A值:3.93±0.23比2.77±0.10,P＜0.01)较LPS刺激组进一步增加,并破坏RPMVEC屏障功能,使RPMVEC通透性增加[(184.17±5.49)％比(151.50±3.08)％,P＜0.01].结论 Cav-1及其磷酸化表达增加参与LPS诱导RPMVEC屏障损伤,PKA信号通路通过调控Cav-1蛋白及其磷酸化表达参与LPS对RPMVEC的致损效应.
