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Mtb-Ag活化γδT细胞的扩增及对γδT细胞CD69分子表达的影响
目的 用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)激活和扩增γδT细胞,观察γδT细胞表面CD69分子表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用Mtb-Ag刺激PBMC,所得细胞用磁珠阳性分选,通过荧光单抗TCR γδPE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例.用γδPE/CD69FITC细胞双染检测初次刺激和再次刺激γδT细胞CD69分子的表达情况.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为(4.9±1.85)％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为(69.2±6.57)％,免疫磁珠阳性分选后达(99.3±8.92)％.Mtb-Ag初次刺激γδT细胞,CD69分子的表达24 h达高峰,为75.2％;Mtb-Ag再次刺激γδT细胞,CD69分子的表达6h达高峰,为72％.结论 Mtb-Ag能特异地刺激PBMC中的γδT细胞增殖,Mtb-Ag初次和再次刺激均可特异性活化γδT细胞.
关键词： γδT细胞 结核杆菌低分子多肽抗原 CD69分子 -
结核杆菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T细胞对诱导γδT细胞CD69分子再次表达的影响
目的 观察结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)再刺激Mtb-Ag活化的T细胞(Mtb-AT细胞)诱导γδT细胞CD69分子的再表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用Mtb-Ag刺激PBMC,采用直接免疫荧光染色法通过CD3PE/CD69FITC、γδPE/CD69FITC细胞双染检测γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的表达情况.PBMC经Mtb-Ag刺激活化扩增培养至10 d后再次加入Mtb-Ag,经培养0、6、12、24、48和72 h后收集细胞,再次检测CD69分子的表达情况.结果 培养0、6、12、24、48和72 h后,Mtb-Ag初次刺激γδT细胞后CD69分子的表达分别为0.91％、15.1％、35.2％、75.2％、59.4％和50％.再次刺激培养0、6、12、24、48和72 h后,γδT细胞CD69分子的表达分别为1.7％、72.3％、73.5％、50.3％、45.6％、41.7％.结论Mtb-Ag初次刺激γδT细胞表达CD69分子约在24 h达高峰,随后快速下降;Mtb-Ag再次刺激Mtb-AT细胞诱导γδT细胞CD69分子的再表达,6h时CD69分子达高峰,可维持到12 h.这为寻求γδT细胞迅速活化、CD69分子的迅速表达奠定了方法学基础.
关键词： γδT细胞 结核杆菌低分子多肽抗原 CD69分子 再刺激 -
三种方式活化T细胞CD69分子表达观察
目的 观察CD3单克隆抗体(CD3mAb)、佛波醇酯+离子霉素(PMA+IM)、结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)活化CD3+T细胞CD69分子的表达情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用CD3mAb(A组)、PMA+ IM(B组)、Mtb-Ag(C组)刺激PBMC,采用流式细胞术检测CD3+T细胞和γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的动态表达情况.结果 CD3+T细胞CD69分子的动态表达情况:CD3 mAb刺激组24 h达高峰,为56.2％;PMA +IM刺激组6h达高峰,为99.5％;Mtb-Ag刺激组24h达高峰,为16％.各组比较F=322.528,P＜0.001;两两比较,均P＜0.001.γδT细胞CD69分子的动态表达情况:CD3mAb刺激组24h达高峰,为55.1％;PMA+ IM刺激组6h达高峰,为99.3％;Mtb-Ag刺激组24h达高峰,为75.2％.各组比较F=21.170,P＜0.001;两两比较:CD3mAb与PMA+ IM组比较,PMA+ IM组与Mtb-Ag组比较,均P＜0.001;Mtb-Ag与CD3mAb比较P=0.646.结论 PMA+ IM的刺激,CD3+T细胞和γδT细胞活化达高峰的用时比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要短,CD69的表达率也比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要高,应作为三种方法中CD3+T细胞活化的首选方法.
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CD69分子在人外周血佛波醇酯+离子霉素活化的γδT细胞表面表达的实验研究
目的 观察CD69分子在人外周血佛波醇酯(PMA)+离子霉素(IM)活化的γδT细胞表面的表达情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用PMA+ IM刺激,采用流式细胞术检测CD3+细胞和γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的动态表达情况.结果 PMA+ IM刺激PBMC 0、6、12、24、48和72 h,CD3+细胞CD69分子的表达分别为1.0％、99.5％、99.1％、98.0％、93.3％、92.1％;γδT细胞CD69分子的表达分别为0.91％、99.3％、98.6％、93.6％、88.7％、87.0％.结论 PMA+ IM的刺激后CD3+细胞和γδT细胞迅速活化,CD69的表达几乎为100％,6h达高峰,随后缓慢下降,两种细胞活化表达CD69基本一致.
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一种CD3+T细胞细胞内CD69分子的检测方法
目的 建立一种人外周血CD3+T细胞细胞内CD69的检测方法 .方法分离获取健康人PBMC,用PMA+IM(佛波醇酯+离子霉素)刺激PBMC,用蛋白转运抑制剂(Brefeldin A,BFA)阻断细胞内因子的分泌,用皂角素(Saponin)破膜,流式细胞术检测CD3+T细胞胞内CD69阳性率,以确定佳的破膜时间.结果 佳的破膜时间为15 min,CD3+T细胞胞内CD69表达的阳性率较高,可达87.82%.结论 流式细胞术是一种检测CD3+T细胞内CD69的较好方法,这一方法也为CD3+T细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础.
