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高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定多花黄精多糖的单糖组成
目的 建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定多花黄精多糖的单糖组成.方法 多花黄精多糖经提取后,用硫酸水解,用CarboPac PA1色谱柱(250 mm×4 mm,10.0 μm)进行分离,采用梯度洗脱,HPAEC-PAD测定多花黄精多糖中单糖的组成.结果 测得各单糖在1～100mg/L线性关系良好(r＞0.999),低检出限为0.015～0.025 mg/L,RSD为1.35％～2.80％,加样回收率为88.36％～111.3％.结果表明不同产地的多花黄精多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖组成.结论 本实验所建立的方法分离效果好,灵敏度高,可用于多花黄精多糖的单糖组成和测定的分析研究.
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梅花鹿鹿茸中促PC12细胞增殖蛋白的分离和活性研究
目的 对冻干鹿茸水溶性组分进行分离,并考察鹿茸水溶性组分及其分离组分对PC12细胞的促增殖活性.方法 应用S-200分子筛凝胶液相色谱和DEAE阴离子交换液相色谱分离鹿茸水溶性组分,进行蛋白质SDS-PAGE电泳分析,Folin-酚法测定鹿茸样品中的蛋白,并用MTT法测定PC12细胞增殖率.结果 鹿茸水溶性组分在13.3 mg/mL能促进PC12细胞增殖47%(P<0.01),其蛋白质量分数为84.2%;经分子筛色谱分离的S200-P2组分具显著促PC12细胞增殖活性(46.0%,97.0μg/mL,P<0.01);经离子交换色谱进一步分离的DEAE-P1组分在51.0/μg/mL下的PC12细胞的增殖率为111.5%(P<0.001).DEAE-P1组分的蛋白主要集中分布于Mr56 000和大于Mr 100 000处.结论 冻干鹿茸的水溶性组分及其液相色谱分离的一个大分子蛋白组分具有显著的促PC12细胞增殖活性,提示这个组分与鹿茸的神经生长因子样活性相关.
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高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗的多糖含量
目的 采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(high performance anion exchange chromatography withpulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)测定b型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗的多聚磷酸核糖基核糖醇(polyribosylribitol phosphate,PRP)多糖含量.方法 用终浓度为0.3N的NaOH溶液将待测疫苗中的PRP多糖或分离得到的游离多糖在室温下振荡水解(16±8)h,采用CarboPac@PA-10阴离子交换柱在NaOH/醋酸钠溶液梯度洗脱条件下分离水解产物,用脉冲安培检测器检测信号,根据样品的峰面积计算得到待测疫苗中的PRP多糖含量及游离多糖含量,样品均重复检测2次,计算2次检测结果的相对标准偏差(RSD).同时采用《中国药典》三部(2010版)附录ⅧJ中的地衣酚法测定相同批次样品的PRP多糖含量及游离多糖含量,并对两种方法得到的结果进行比较.结果 相同样品重复检测2次,结果间的差异非常小,RSD不超过4.6％.HPAEC-PAD法测得的总PRP结果与地衣酚法测得的结果接近,前者测得的S01～S03样品的PRP浓度值分别为后者的105％、104％和106％; HPAEC-PAD法测得的游离PRP结果与地衣酚法测得的结果差别较大,前者测得的S01～S03样品的游离PRP浓度值分别为后者的126％、109％和115％.结论 HPAEC-PAD法测定Hib结合疫苗的PRP多糖含量灵敏度高,重复性和分离效果好,样品不需要衍生处理,可同时测定多组分,可作为传统地衣酚法的替代方法用于Hib结合疫苗中多糖含量的测定.
关键词： 阴离子交换色谱 脉冲安培检测 b型流感嗜血杆菌结合疫苗 多糖 -
野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2在E. Coli中的表达和纯化研究
目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因在E.coli重组表达,纯化重组SEC2(rSEC2)并进行生物学活性分析.方法 PCR获得正确编码SEC2的基因片断,构建表达质粒pET -28a-sec2在E.coli BL21中表达.利用离子交换和分子筛色谱纯化rSEC2,四甲基偶氮唑盐(MTT)法对rSEC2和天然SEC2(nSEC2)生物学活性进行分析和比较.结果 可溶性rSEC2占菌体总蛋白质的40%,两步纯化后蛋白质纯度约达9 5%,rSEC2和nSEC2均具有显著的超抗原活性.结论 成功获得与nSEC2有着类似活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白质的抗肿瘤机理奠定物质基础.
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积分脉冲安培检测-高效阴离子交换色谱法测定盐酸氨基葡萄糖口腔崩解片含量
目的 建立测定盐酸氨基葡萄糖口腔崩解片含量的方法.方法 采用积分脉冲安培检测-高效阴离子交换色谱法测定盐酸氨基葡萄糖,优化了淋洗条件和积分脉冲安培检测条件.结果 盐酸氨基葡萄糖的检测限为0.05 ng,线性范围为0.1～40 μg/mL,盐酸氨基葡萄糖口腔崩解片的加样回收率为100.1%,RSD为1.17%(n＝9).结论 此法可简单、快速、灵敏、准确地测定盐酸氨基葡萄糖口腔崩解片的含量.
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海带低分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备和抗血小板聚集活性研究
目的 研究低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备和纯化技术,筛选抗血小板聚集活性的低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯.方法 以海带硫酸多糖为原料,采用自由基降解和强阴离子交换色谱技术,制备纯化出高硫酸根和高岩藻糖的低分子量岩藻聚糖硫酸酯;采用体外凝血酶诱导血小板聚集模型,筛选出抗血小板聚集活性的低分子量岩藻聚糖硫酸酯.结果 强阴离子交换色谱能够有效地将复杂的低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯分离纯化,得到4个纯度较高的高硫酸根、高岩藻糖的低分子量多糖,其岩藻糖含量超过85％～95％,硫酸根含量35％以上,分子量在20～30 ku.体外抗血小板聚集试验结果证明,这4个高硫酸根高岩藻糖组分的抗血小板聚集活性高,而低硫酸根组分含有较高的半乳糖、甘露糖和糖醛酸,其抗血小板活性非常低.结论 采用自由基氧化降解和强阴离子交换色谱法,可获得抗血小板活性高的高硫酸根高岩藻糖的低分子量岩藻聚糖硫酸酯.
关键词： 海带 低分子量岩藻聚糖硫酸酯 阴离子交换色谱 抗血小板聚集 凝血酶 -
五步蛇毒凝血酶样酶分离纯化
目的:探讨从五步蛇毒中分离纯化凝血酶样酶的有效方法.方法:用Superdex 75、Superdex 30凝胶过滤色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱技术层析,SDS-PAGE分析纯度.结果:从五步蛇毒中分离纯化得到一个具有凝血活性的组分.SDS-PAGE显示为单一条带,相对分子质量约25 kDa.结论:用Superdex 75、Superdex 30凝胶过滤色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱技术可以很好分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶.
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阴离子交换色谱纯化甲型肝炎病毒(YN5株)的研究
对阴离子交换色谱纯化HAV的合适条件进行了探索.先使用"试管法"研究DEAE Sepharose Fast Flow凝胶结合HAV及病毒解离的条件,然后分别使用线性阶段洗脱和阶段梯度洗脱在柱色谱上进行了HAV的纯化.结果表明经过阴离子交换色谱纯化得到的病毒保持有抗原性和免疫原性,HAV抗原回收率大于85%,杂蛋白去除率大于80%,纯化的病毒样品中的内毒素与宿主DNA的含量也大大降低,证明阴离子交换色谱可用于HAV疫苗的纯化.
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高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖及游离多糖的含量
目的:建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗的多糖及游离多糖含量.方法:将疫苗中的有效抗原成分—Hib多糖,其结构为多聚磷酸核糖基核糖醇(polyribosylribitol phosphate,PRP),用6 mol·L-1盐酸进行水解,得到其核糖醇(ribitol)单体;使用CarboPac(R) MA1阴离子交换柱(4 mm×250 mm),以580 mmol·L-1氢氧化钠溶液为流动相,流速为0.4 mL· min-1,柱温35℃,进样体积100 μL,脉冲安培检测器收集信号,核糖醇的含量以峰面积计算得到,再根据核糖醇占PRP干重的质量分数(41.3％),计算出Hib结合疫苗中PRP及游离多糖(Free PRP)的含量,并评估该方法的重复性和再现性.结果:核糖醇质量浓度在0.075～1.05μg·mL-1范围内,与峰面积响应值呈良好的线性关系(r=-0.999 9),低检测限为2.5 ng·mL-1;标准品供试溶液连续进样6次,峰面积及保留时间的RSD均小于5％;核糖醇加标回收率在80％～120％之间;对来自5个企业的4个不同批次的Hib结合疫苗的PRP及Free PRP含量进行测定,结果均符合规定.结论:本方法在测定Hib结合疫苗的PRP及Free PRP含量时,样品前处理简单,分离效果好,且灵敏度高,结果稳定,可靠,对控制该疫苗的质量具有重要意义.
