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SARS冠状病毒PUMC2株全基因组cDNA分段克隆
目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA.方法以SARS冠状病毒PUMC 2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接人pGEM-T载体中,进行序列测定.结果获得了SARS冠状病毒PUMC 2株基因组全长cDNA的分段克隆.结论SARS冠状病毒PUMC 2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础.
关键词： SARS冠状病毒PUMC2株 分段克隆 -
酶连接介导PCR法构建酵母PMT3基因缺失菌株
目的 本文运用酶连接介导的PCR法构建酿酒酵母PMT3基因缺失菌株.方法 以酿酒酵母基因组DNA为模板,PCR扩增PMT3基因开放阅读框两侧片段,双酶切后,定向克隆于pRS305载体;限制性内切酶MluⅠ线性化基因缺失重组载体(pRS305-pmt3-ko),采用醋酸锂的方法将重组载体转化酵母细胞;经营养缺陷型培养基筛选,PCR法验证阳性克隆酵母菌株.结果 基因缺失重组载体测序正确,PMT3基因缺失酵母菌株构建成功.结论 利用基因缺失重组载体pRS305-pmt3-ko,成功构建PMT3基因缺失酵母菌株.
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PCR重叠延伸法结合分段克隆技术构建高GC含量基因突变载体
目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础.方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术.结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功.结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50％),全长为2 500 bp的人类KAP-1基因定点突变载体pCMV6-Entry-KAP-1,为全面深入研究KAP-1基因的功能奠定了基础.
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人VIGILIN基因分段克隆及表达
目的 探讨入高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制.方法 根据VIGILIN基因全长编码区的结构域,将VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X 3原核表达载体,测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果.结果 成功扩增了人VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功.结论 本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST融合蛋白.
