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鸡胚尿囊膜(HET-CAM)眼刺激替代试验对产品及原料评价的比较
目的 比较鸡胚尿囊膜试验(HET-CAM)作为一种眼刺激替代方法对产品或原料的评价.方法 采用HET-CAM和兔眼Draize试验方法,对19种原料和23种化妆品及家用洗涤产品眼刺激性进行检测,对体内体外试验的结果进行统计比较.结果 比较体内体外试验,原料和产品的kappa系数分别为0.826,0.531;灵敏度分别为100%,81.8%;特异度分别为85.7%,77.8%.结论 HET-CAM可作为Draize试验的替代试验,HET-CAM系统更适合对单纯化学品原料进行眼刺激试验.
关键词： 鸡胚尿囊膜试验 Draize眼刺激试验 替代试验 -
人血管内皮抑制素vasostatin120-180在大肠杆菌中的表达纯化及初步的抗血管生成活性研究
目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180(VAS)基因,并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定.方法:根据大肠杆菌偏爱密码子,应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段(即VAS)的编码基因.通过PCR和限制性内切酶消解,将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中,并在BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白.VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45%,大多数目的蛋白以包涵体形式存在,经过体外包涵体变性、复性及纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定.结果:经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-VAS构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,Western blotting分析并鉴定了VAS的分子属性.通过鸡胚尿囊膜试验验证,重组VAS蛋白能够很好地抑制微血管生成.结论:获得高效表达的、高纯度的VAS,为VAS进一步的功能分析和抑制血管生成活性研究奠定了基础.
关键词： 偏爱密码子 血管内皮抑制素120-180 包涵体 变复性 鸡胚尿囊膜试验 -
hVEGF siRNA抑制A549细胞在裸鼠移植瘤的早期生长及血管新生
目的:探讨血管内皮细胞生长因子(human vascular endothelial growth factor,hVEGF)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对A549细胞裸鼠移植肿瘤生长以及对鸡胚尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)上诱导新生血管的影响.方法:分别构建3个表达不同特异性hVEGF siRNA序列的质粒载体,与表达无关序列siRNA质粒载体分别转染A549细胞,用ELISA与realtime RT-PCR选出抑制hVEGF效果佳的hVEGF siRNA质粒.G418筛选出稳定表达抑制效果佳的hVEGF siRNA和表达无关序列siRNA的A549细胞,与未转染的A549细胞分别注射于裸鼠皮下,观察3组细胞在裸鼠皮下成瘤及肿瘤生长的速度.鸡胚尿囊实验:孵育至第9天的白皮受精种蛋随机分为4组,分别在鸡胚尿囊膜表面加未培养过A549细胞的DMEM培养液(阴性对照组),未转染的A549细胞培养上清液(阳性对照组),转染hVEGF siRNA的A549细胞培养上清液(hVEGF siRNA组),转染无关序列siRNA的A549细胞培养上清液(无关序列siRNA组),继续孵育48 h,取固定后的鸡胚绒毛尿囊膜于显微镜下计数血管分支点和血管分支长度.结果:hVEGF siRNA使A549细胞表达mRNA水平大下降70%,分泌hVEGF水平大下降48%.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA组比无关序列siRNA组肿瘤平均体积减少58%,肿瘤生长到50 mm3的平均时间延迟5.4 d,移植肿瘤组织匀浆hVEGF含量降低54%;而肿瘤的倍增时间与肿瘤生长速率差异不显著.在鸡胚尿囊膜实验中,阴性对照组加样液的hVEGF含量为0,hVEGF siRNA组加样液的hVEGF含量约占无关序列siRNA组和阳性对照组的40%～44%;血管分支点计数,hVEGF siRNA组,无关序列siRNA组与阳性对照组比阴性对照组增加45%～55%;血管分支总长度hVEGF siRNA组比阴性对照组增加约53%,无关序列siRNA组和阳性对照组比阴性对照组分别增加约97%及99%.CAM血管图上与阴性对照组比较VEGF siRNA组可见增多的血管分支,阳性对照组和无关序列siRNA组上还可以见血管分支增粗、增长.结论:构建并证实质粒介导的hVEGF siRNA能抑制A549细胞分泌VEGF,从而抑制A549细胞诱导鸡胚尿囊膜的血管新生.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA能抑制肿瘤早期生长,对肿瘤后期的生长速率无显著抑制.
