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长爪沙鼠Eef1a2基因的克隆与同源性分析
目的 长爪沙鼠真核蛋白延长因子1a2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,Eef1a2)基因的克隆,测序和同源性分析.方法 提取长爪沙鼠骨骼肌组织的mRNA,通过同源扩增和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆Eef1a2 cDNA序列全长.通过DANSTAR软件比对长爪沙鼠和人类、大鼠、小鼠Eef1a2的cDNA和氨基酸序列,并分析其同源性.结果 长爪沙鼠Eef1a2 cDNA序列全长1812 bp,编码区(coding sequence,CDs) 1392 bp,编码463个氨基酸.其核苷酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为88.6％,94.0％和93.8％;长爪沙鼠Eef1a2氨基酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为100％,99.9％和99.9％.结论 长爪沙鼠Eef1a2的核苷酸序列和氨基酸序列均与人、大鼠、小鼠高度同源.因此,长爪沙鼠可能是一种人类Eef1a2基因研究的理想模型.
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eEF1A1低表达对肝癌细胞凋亡、增殖与迁移的影响及eEF1A1/A2与ANXA7间的相互作用
[目的]研究shRNA抑制eEF1A1表达对肝癌Hea-P细胞凋亡、增殖、迁移的影响,并通过分别下调eEF1A1和ANXA7的表达,探讨肝癌Hca-P细胞中eEF1A1、eEF1 A2与ANXA7表达的相关性及潜在的相互作用.[方法]构建靶向eEF1A 1基因的shRNA质粒表达载体,瞬时转染至小鼠肝癌Hca-P细胞中,设无处理组(CON) 、eEF1A1-shRNA组(eEF1A 1-shRNA)、转染pGPU/GFP/Neo-NC的阴性埘照组(NC)三组细胞进行实验.采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测eEF1A1的抑制效果,并分别检测各组eEF1 A2、ANXA7在mRNA和蛋白水平的表达.CCK-8法、流式细胞仪、Transwell小室分别检测对细胞增殖、凋亡、迁移的影响.此外,复苏已稳定低表达ANXA7的Hca-P细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测无处理组(CON)、ANXA7-shRNA转染组(ANXA7-shRNA)、阴性对照组(NC)三组Hca-P细胞中eEF1A1、eEF1A2在mRNA和蛋白水平的表达.[结果]eEF1A1靶向shRNA成功下调小鼠肝癌Hca-P细胞中eEF1A1基因的表达.流式细胞仪检测显示,CON组、eEF1A1-shRNA组、NC组细胞凋亡率分别为2.85％±0.37％、4.71％±0.21％和3.01％±0.33％,eEF 1A1-shRNA组的细胞凋亡较CON组和NC组明显增加(P＜0.05):CCK-8实验发现,eEF1 A1-shRNA转染细胞后细胞增殖能力较CON组和NC组明显下降;Transwell实验显示,CON组、eEF1A1-shRNA组、NC组迁移细胞数目为123.75±9.26、66.84±17.47、115.31±12.59,eEF1A 1-shRNA组细胞迁移能力较CON组和NC组显著减弱(P＜0.05).qRT-PCR和Western blot检测显示,eEF1A1-shRNA组eEF1A2、ANXA7在mRNA和蛋白水平的表达量较CON组和NC组明显降低(P＜0.05),相较其无处理组的蛋白表达水平,eEF1A2和ANXA7分别下降了57％和21％;ANXA7-shRNA组中eEF1A1、eEF1A2在mRNA和蛋白水平的表达量较CON组和NC组亦明显降低(P＜0.05).[结论]通过靶向eEF1A1的shRNA使eEF1A1低表达,可诱导细胞凋亡,抑制细胞的增殖能力及迁移能力.eEF1A1 、eEF1A2与ANXA7的表达密切相关,且eEF1A1与ANXA7存在相互作用,可能共同参与调控肿瘤的发生与发展.
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EEF1A2嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的:克隆人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)基因全长.构建其重组腺病毒载体.方法:应用RT-PCR方法从人胰腺癌组织中扩增人EEF21A2基因全长,经T-A克隆后,亚克隆到腺病毒穿梭质粒pDC316,构建穿梭质粒pDC316-EEF1A2.利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-EEF1A2共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2,经过在293细胞中包装和扩增之后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2.PCR、Western Blot检测EEF1A2基因的表达.结果:用RT-PCR方法,从人胰腺癌组织中扩增出1 400 bp的cDNA片段,经测序证实为人EEF1A2基因.构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-EEF1A2.结论:成功地克隆了人EEF1A2基因全长,并构建其表达的重组腺病毒载体,为进一步研究人EEF1A2基因在相关疾病中的作用奠定了基础.
