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利用高内涵分析技术进行药物肾细胞毒性筛选的研究
目的 探讨利用高内涵分析技术对药物进行肾毒性筛选的可行性.方法 选择罗格列酮(rosiglitazone)为阴性药,缬氨霉素(valinomycin)为阳性药,利用高内涵分析技术,通过检测细胞数目(cell number)、DNA含量(DNA intensity)、细胞膜通透性(cell permeability)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、细胞色素C(cytochrome C)的释放这5个指标,建立高内涵HK-2肾细胞毒性筛选模型并利用具有明显肾毒性的药物马兜铃酸A(aristolochic acid A)和顺铂(cisplatin)对该模型进行验证.结果 缬氨霉素、顺铂和马兜铃酸A可以检测到明确的HK-2肾细胞毒性,而罗格列酮即使在药物浓度为大血药浓度的1 000倍情况下仍然不会检测到明显的HK-2肾细胞毒性.结论 基于HK-2肾细胞,高内涵平台可以用于对药物进行肾细胞毒性筛选.
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基于高内涵分析技术的何首乌提取物及其主要成分肝毒性研究
目的 建立高通量的高内涵分析(HCA)技术,探讨何首乌致肝损伤的可能物质及作用机制.方法 人源肝癌细胞HepG2分别经不同质量浓度的何首乌不同极性提取物、何首乌主要单体成分二苯乙烯苷、芦荟大黄素、大黄素甲醚、儿茶素、大黄酚、大黄素、大黄酸、没食子酸孵育24 h后,利用Hoechst 33342等荧光探针对细胞进行染色,利用HCA技术检测并分析药物在不同浓度或不同孵育时间时对HepG2的细胞数目、细胞核形态、线粒体质量和线粒体膜电位的影响.结果 何首乌醋酸乙酯提取物和二氯甲烷提取物在1 000μg/mL时对HepG2细胞增殖、形态和线粒体质量均有显著的影响,醋酸乙酯提取物还引起线粒体膜电位的明显下降.何首乌各单体成分在较低浓度(0.01、1μmol/L)时对细胞无显著影响;而在较高浓度(100μmol/L)时,芦荟大黄素、大黄素、大黄酸和没食子酸可引起细胞数目的明显下降,芦荟大黄素还引起细胞核的肿胀、导致细胞核面积增大.由大黄素和大黄酸的量效曲线可知,二者对细胞各指标的半数毒性浓度(TC50)值与文献报道基本一致.各成分不同孵育时间(24、48、72 h)对细胞数目和细胞核面积的影响未出现显著差异.结论 葸醌类成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酸和没食子酸可能是何首乌致肝毒性的主要成分,由各单体对线粒体质量和线粒体膜电位的影响推测何首乌致肝毒性可能与线粒体介导的细胞凋亡有关.HCA技术适用于中药复杂体系的肝毒性评价.
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抗肾纤维化药物高内涵筛选模型的建立及应用
目的 建立可用于高内涵分析的肾纤维化体外的细胞模型,为抗肾纤维化中药化合物的筛选和机制研究奠定基础.方法 本研究通过TGF-β1诱导正常大鼠肾成纤维细胞NRK49F,以肌成纤维细胞标志 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)作为检测指标,通过高内涵成像分析系统对α-SMA荧光表达强度进行检测分析,并对细胞种板密度、诱导时间、诱导培养基中血清浓度等各种条件进行优化,建立稳定的肾纤维化体外模型.在此基础上以TGF-β1受体阻滞剂SB525334和姜黄素、大黄素对模型进行验证.并进一步探讨吡非尼酮是否具有抗肾纤维化功效.结果 实验通过对细胞密度、诱导时间、培养基中血清浓度进行优化,确立了可用于高内涵分析的NRK49F肾纤维化体外模型的建立条件.SB525334、姜黄素、大黄素和吡非尼酮均能减少TGF-β1诱导的α-SMA过表达,抑制NRK49F的活化.结论 实验建立了可用于高内涵筛选技术的肾纤维化体外模型,并能相对稳定地筛选具有抗肾纤维化作用的药物.吡非尼酮在本模型中抑制了成纤维化细胞向肌成纤维细胞转化,提示其可能具有抗肾纤维化作用,为抗肾纤维化药物初筛对象的选择提供了思路.
