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OPTN基因的低表达对大鼠视网膜神经节细胞存活影响的研究
目的 观察大鼠OPTN基因的低表达对视网膜神经节细胞系(RGC5)亚细胞形态结构及存活的影响.方法 实验研究.设计并合成特异性针对Sprague-Dawley(SD)大鼠OPTN的3对RNA干扰片段(siRNA),体外培养SD大鼠星型胶质细胞,取对数生长期的细胞做实验,分别将3对siRNA(si-OPTN-001、si-OPTN-002、si-OPTN-003)通过脂质体Lipofectemine 2000转染入星型胶质细胞,24 ～ 48 h后采用实时PCR和Western Blot检测siRNA的干扰效果,筛选出抑制效果佳的序列;以筛选出来的siRNA序列构建绿色荧光蛋白EGFP标记的si-OPTN,并通过Lipofectemine 2000包裹转染RGC5,将RGC5分为4组:空白对照组,绿色荧光蛋白真核细胞表达载体(pEGFP)阳性对照组,si-OPTN组,脂质体阴性对照组.转染24～48 h后用细胞器特异荧光染料标记细胞内不同细胞器结构,通过共聚焦荧光显微镜来观察表达的si-OPTN在RGC5内的分布、定位及其对细胞器形态结构的影响;通过形态学观察和Hoechst33342-PI荧光染色观察si-OPTN对RGC5存活的影响.实验中不同组间的总体比较采用单因素方差分析.结果 实时PCR及Western Blot的结果显示:转染si-OPTN-001、si-OPTN-002和si-OPTN-003 24 h后星型胶质细胞内OPTN的mRNA表达下降,分别为阴性对照组的(61.71±0.84)％、(48.13±0.92)％和(46.22±0.73)％,而转染si-OPTN-001、si-OPTN-002和si-OPTN-003 48 h后星型胶质细胞内OPTN的蛋白表达水平下降,分别为阴性对照组的(64.44±2.01)％、(57.78±1.97)％和(37.78±1.84)％,其中si-OPTN-003与阴性对照组相比降低显著;si-OPTN转染RGC5细胞24 h后的转染效率为(17.43±0.94)％;转染48 h后的转染效率为(20.13±1.24)％;表达的si-OPTN在细胞内基本上均匀分布于整个细胞,覆盖胞质和胞核,与阴性对照组细胞器染色情况比较,转染细胞内的肌丝蛋白、线粒体、溶酶体及高尔基体形态结构未见明显损伤性改变;Hochest33342/PI荧光染色结果显示:转染24 h,与空白对照组(0.74±0.34)％和阴性对照组(0.96±0.41)％比较,EGFP阳性对照组及si-OPTN组整组的RGC5细胞凋亡率均增加,差异有统计学意义(F=5.457,P＜0.05),但si-OPTN组转染质粒的细胞凋亡率明显低于阳性对照组,差异有统计学意义(F=6.541,P＜0.05).随转染时间延长,在转染48 h时,阳性对照组凋亡率较24 h时下降,si-OPTN组凋亡率稍升高但无统计学意义(F=3.212,P＞0.05),且仍低于阳性对照组.结论 相较于另2对si-RNA,si-OPTN-003更能有效地抑制OPTN的表达;si-OPTN转染RGC5后均匀分布于全细胞,对细胞内的亚细胞器结构未见明显损伤性改变;通过转染si-OPTN使OPTN表达降低可能对RGC5的存活有保护作用.
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OPTN基因与POAG的分子生物学研究进展
原发性开角型青光眼(POAG)是以视野渐进性缺损为特点的遗传异质性的综合性神经退行性疾病.OPTN基因是近年来已被确认的POAG的致病基因,该基因的突变可导致其所表达蛋白Optineurin结构及功能的异常.Optineurin与一些特定蛋白配体偶联后发挥相应的分子生物学功能,当其结构异常时,将导致Optineurin不能与其配体偶联或者偶联后功能异常.本综述主要介绍OPTN基因的结构、定位,其表达蛋白Optineurin的结构,Optineurin与配体偶联后的分子生物学功能,以及OPTN基因突变后与POAG发病的关系等方面的研究进展.
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OPTN基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效应的检测
目的通过构建针对视神经病变诱导基因( OPTN)的shRNA的真核表达载体,并转染 HEK293FT 细胞,实现对OPTN基因表达的抑制,为进一步研究OPTN蛋白的分子机制奠定基础。方法根据Origene中OPTN基因序列设计并合成能转录 shRNA 的双链 DNA 序列,插入真核表达载体pRFP-C-RS中,构建重组载体 pRFP-C-RS-shOPTN。经鉴定正确后转染HEK293FT细胞,荧光显微镜下观察shRNA转染情况,Western blot法检测OPTN蛋白表达,检测其干扰效率；沙门菌感染实验检测沙门菌在细胞内的增殖,进一步检测OPTN蛋白干扰后对OPTN蛋白作为自噬受体功能的影响。结果成功构建了针对 OPTN 基因的 shRNA 表达载体,转入HEK293FT 细胞72 h 之后,pRFP-C-RS-shOPTN 表达增强, OPTN蛋白表达受到明显抑制；细胞内的沙门菌感染实验证明OPTN蛋白可以显著抑制沙门菌的增殖。结论靶向OPTN基因的特异性shRNA转染HEK293FT细胞后可抑制OPTN蛋白表达效率达80%以上,可用于OPTN调控自噬的进一步研究,同时自噬调节蛋白OPTN可以显著抑制沙门菌在细胞内的增殖。
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Optineurin在POAG发病机制中作用的新研究
目前已知有8个基因位点与青光眼有关,其中2个有关原发性开角青光眼(primary open-angle glaucoma, POAG)基因已被确定:MYOC/TIGR基因编码myocilin,主要与青少年型POAG有关;另一个与成人型POAG特别是正常眼压性青光眼(Normal tention glaucoma,NTG)有关的基因,称为OPTN,其编码的蛋白产物为optineurin,含义是引起视神经病变的蛋白.
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慢性移植物失功的器官特异性:基于OPTN数据的分析
目的 寻找不同移植器官发生慢性移植物失功(chronic graft dysfunction,CGD)的变化规律,证实不同器官CGD发生率不同与移植器官种类有关,即CGD的器官特异性.方法 网上获取OPTN/SRTR(organ procurement and transplantation network/scientific registry of transplant recipient)2006年报,收集近10年全球29.6万余例各种实体器官各时点移植物存活率.根据总表统计数据用图示法寻找移植物存活率在各种移植实体器官的变化趋势;根据分表统计数据,按不同年龄组、性别和人种作图,进一步观察趋势.以不同时段移植物存活率为变量,分层聚类分析,将各种实体移植器官分成两类.确定低存活标准,将各种实体移植器官不同时段移植物存活率与之比较,用森林图法直观展示高低不同的两类.结果 各时段边缘供肾、单独胰腺移植、肾移植后胰腺移植、小肠移植、尸肺移植和心肺移植的移植物存活率在不同年龄段(18～34、35～49、50～64岁)、性别和人种均较低.以各种实体器官移植1991～1995年和1996～2000年两个时段的1年、3年和5年移植器官近期存活率(GSR)为变量聚类分析,上述低存活器官聚为一类,与低存活率相关.以边缘供肾GSR为标准,上述低存活器官两个时段3月、1年、3年和5年GSR均比边缘供肾低[3月GSR,OR 0.26～0.92;95%CI(0.20,0.35)～(0.61,1.39);1年GSR,OR 0.30～0.87,95%CI(0.23,0.37)～(0.78,0.97);3年GSR 5年GSR,OR 0.12～0.87;95%CI(0.09,0.71)～(0.75,1.0)].结论 CGD在不同器官的变化具有规律性.各种实体移植器官GSR可聚为高低存活两类,低GSR器官为边缘供肾、单独胰腺移植、肾移植后胰腺移植、小肠移植、尸肺移植和心肺移植,表现为高发早发CGD.
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OPTN 基因与原发性开角型青光眼
2002年Rezaie等报道 OPTN 基因的突变可能导致POAG正常眼压性亚型,并推测 OPTN 基因在视神经损害过程中可能起到保护作用.本综述主要介绍了该基因的定位、克隆、结构、功能以及突变的研究.
