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人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性
目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV) 58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性.方法 分别定点突变HPV58型E6和E7基因中3个氨基酸的密码子,去除突变后的E6和E7基因的终止码并将其基因片段融合,突变修饰后的基因命名为HPV58 mE6E7.将重组质粒转染NIH/3T3细胞,pIRES-neo-HPV58 mE6E7转染组为实验组,pIRES-neo-HPV58 E6E7转染组为阳性对照组,pIRES-neo空载转染组为阴性对照组.流式细胞术、免疫荧光和Western blot检测转染细胞HPV58 mE6E7融合蛋白的表达,软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测HPV58mE6E7融合蛋白的转化活性.以HPV58 mE6E7融合基因为靶抗原构建DNA疫苗,免疫小鼠后采用酶联免疫吸附试验检测免疫鼠血清中特异性抗体,酶联免疫斑点法检测免疫鼠脾淋巴细胞中可分泌γ干扰素的特异性CD8+T细胞数.结果 将pGEM-T easy/HPV58 mE6E7和pMD-18T/HPV58 E6E7质粒分别测序,HPV58 E6E7融合基因与HPV58型E6和E7基因标准序列的同源性达100％,并证实点突变成功.稳定转染HPV58mE6E7和HPV58 E6E7的NIH/3T3细胞表达率分别为70.3％和84.1％.实验组和阳性对照组HPV58mE6E7和HPV58 E6E7融合蛋白的相对表达水平分别为2.1±1.7和3.8±1.4,阴性对照组HPV58 mE6E7和HPV58E6E7融合蛋白呈阴性表达.实验组和阴性对照组未见集落形成；阳性对照组有31个集落形成,其中＞ 50个细胞的集落10个.实验组和阴性对照组细胞接种裸鼠后,在4周内均未成瘤；而阳性对照组中有6只裸鼠形成肿瘤.以HPV58 mE6E7融合基因为靶抗原的DNA疫苗具有良好的抗原性,抗体滴度为25 600,特异性免疫斑点数为(218.8 ±34.4)个,明显高于对照组.结论 修饰后的HPV58E6E7基因可融合表达,并在消除其转化活性的同时保留其抗原性,可作为HPV58阳性相关肿瘤治疗性DNA疫苗的靶基因.
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陕西地区妇女乳腺癌组织中58型人乳头瘤病毒感染分析
目的：检测乳腺癌组织中58型人乳头瘤病毒E7基因，探讨人乳腺癌组织中是否存在HPV58感染。方法采用聚合酶链反应技术（PCR），结合人乳头瘤病毒（HPV）型特异性引物，检测了141例乳腺癌组织和55例非癌乳腺病变组织中的HPV58 E7基因。结果141例乳腺癌标本PCR结果显示，HPV58 E7基因检出率为12．06％（17/141），55例非癌乳腺病变组织中HPV58 E7基因检出率为1．82％（1/55），两者存在显著性差异（χ2＝4．973，P＝0．026）。结论 HPV58在乳腺癌组织中有相当高的感染率，提示可能与乳腺癌的发生有关。
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高危人乳头瘤病毒58型E6基因的克隆及表达
目的:获得含人乳头瘤病毒（HPV）58型E6基因的克隆及表达重组体并体外表达E6蛋白. 方法：聚合酶链方法从1例宫颈腺癌患者癌组织DNA中获得HPV58 E6基因，并将其与克隆载体pGEM-T Easy连接，获得重组体HPV58-E6-pGEM-T，继之以双酶切将E6基因与同样双酶切的线性化的pRSET-A表达载体连接，得到E6表达重组体pRSET-58E6，转化E.coli BL21(DE3)，用IPTG诱导表达. 结果：从1例宫颈癌患者中成功获得了少见HPV58型的E6基因并构建了其重组表达载体. 经IPTG诱导后可表达Mr 24 000的6His HPV58 E6融合蛋白，表达量占菌体蛋白的10%. 结论：成功获得了少见HPV58高危型的E6基因，并可在E.coli中高效表达.
