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重组腺病毒rAD-mTERT-m4-1BBL与T淋巴细胞混合培养对小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的免疫杀伤作用
目的 研究在T淋巴细胞混合培养条件下,腺病毒rAD-mTERT-m4-1BBL(简称rAD-mTERT)对小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的免疫杀伤作用.方法 分别以rAD、rAD-CMV-m4-1BBL(简称rAD-CMV)和rAD-mTERT转染Hepa1-6和1929细胞,检测其生长和凋亡变化.将转基因细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养,观察T淋巴细胞表型变化及转基因细胞的生长和凋亡变化.细胞生长的检测采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,细胞凋亡的检测采用Annexin V-碘化丙啶(PI)双染色法.结果 rAD、rAD-CMV和rAD-mTERT病毒对Hepa1-6和L929细胞均有明显的生长抑制作用和轻度的促凋亡作用.与活化T淋巴细胞混合培养后,各组转基因Hepa1-6和L929细胞的生长均受到抑制,以rAD-CMV+T淋巴细胞组为明显;rAD-CMV对Hepa1-6和L929细胞的促凋亡作用均十分明显,rAD-mTERT仅对Hepa1-6细胞有明显的促凋亡作用.混合培养后,CD4~+和CD8~+T淋巴细胞均出现一定程度的增殖,但CD8~+T淋巴细胞增殖明显强于CD4~+T淋巴细胞,CD4/CD8比值从混合培养前的1.27下降为混合培养后的1.08.结论 单纯腺病毒可以抑制靶细胞的生长,但不促进其凋亡.在与T淋巴细胞混合培养下,重组腺病毒载体rAD-mTERT可靶向抑制Hepa1-6细胞的生长并促进其凋亡,其促凋亡作用是通过T淋巴细胞的免疫杀伤作用实现的.
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人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达
目的:从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因,构建其真核表达质粒,并在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中进行表达.方法:从HepG2中提取总RNA,采取逆转录PCR(RT-PCR)方法得到人LDLR的cDNA.将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3-hLDLR和空载体转入Hepa1-6,G418筛选,并用RT-PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达.结果:人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3-hLDLR,双酶切和测序表明,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性,但编码的氨基酸序列完全一致,该序列的GenBank登录号为gi|21629647|gb|AY114155.1,并且真核表达质粒的构建正确.用脂质体介导的方法转入Hepa1-6后,用RT-PCR和FACS检测表明,细胞可表达人LDLR.结论:成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-hLDLR,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础.
关键词： 低密度脂蛋白受体(LDLR) 克隆 基因表达 Hepa1-6细胞 质粒 -
藻蓝蛋白对Hepa1-6细胞及荷瘤小鼠免疫功能影响
原发性肝癌是严重危害人类健康和生命的疾病,东南亚地区高发,全球每年有31万患者,其中中国有13万患者死于肝癌,占全球肝癌死亡总数的42％.肝癌高发年龄为35 ～ 45岁,男性多于女性,男女之比为2～5∶1.中国为肝癌高发区,治疗肝癌主要方法是手术和肝移植,难于被患者接受,且大多数患者不具备手术适应症,如晚期肝癌和肝功能极差患者1].
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肺癌肿瘤抑制因子1基因过表达对肝细胞糖脂代谢相关基因表达的影响
探讨肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)基因表达上调对小鼠肝癌细胞Hepal-6糖脂代谢相关基因mRNA表达的影响.结果 显示,TSLC1基因过表达降低脂代谢基因脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的表达(P<0.05或P<0.01),增加脂肪组织甘油三酯水解酶(ATGL)的表达(P<0.05),对激素敏感脂肪酶(HSL)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)1和GLUT4的表达无显著影响,提示TSLC1过表达可能抑制肝细胞的脂肪生成,促进脂肪分解.
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快速大容量尾静脉注射法构建循环肝癌细胞肝转移小鼠模型
目的:通过快速大容量尾静脉注射方法构建循环肝癌细胞肝内复发转移小鼠模型.方法:40只C57 BL/6J小鼠采用随机数字表法随机分为对照组和实验组(20只/组),对照组采用传统的缓慢小容量尾静脉注射法(2×106个肝癌Hepa1-6细胞/0.2 ml,30 s内注射完毕),实验组采用改良的快速大容量尾静脉注射法(2×106个肝癌Hepa1-6细胞/2 ml,5 s内注射完毕)构建循环肝癌细胞肝内复发转移小鼠模型.4周后摘取肝、肺、肾、脾组织并行H-E染色,大体和镜下观察肝脏、肺脏、脾脏和肾脏的成瘤情况.结果:对照组小鼠只在肺脏有转移灶形成,成瘤率为95％ (19/20),肝脏、肾脏、脾脏未见有转移灶形成.实验组小鼠在肝脏和肺脏同时形成转移灶,肺脏成瘤率为94.7％(18/19),肝脏成瘤率为100％(19/19),脾脏、肾脏未见转移灶形成.结论:快速大容量尾静脉注射法注射循环肝癌细胞构建的小鼠模型可以模拟肝癌根治性切除后残留的循环肝癌细胞导致早期肝癌肝内复发转移的过程.
关键词： 循环肝癌细胞 Hepa1-6细胞 肝转移 快速大容量尾静脉注射 动物模型 -
MiR-384对HFFA诱导的Hepa1-6细胞sirt3/FOXO1信号通路的影响
目的 观察MiR-384对HFFA诱导的Hepa1-6细胞sirt3/FOXO1信号通路的影响.方法 取Hepa1-6细胞,加入OA和PA储存液,使两者终浓度分别为1 mmol/L和0.5 mmol/L,培养24 h,建立非酒精性脂肪性肝炎体外细胞模型.测定肝细胞内活性氧水平评估模型建立的情况.分别以miR-384模拟物、miR-ctrl、miR-384抑制剂、miR-384抑制剂-ctrl、沉默信息调节因子3(Sirt3)或si-ctrl转染细胞48 h.使用FCM测定各组细胞ROS水平,采用Western blot法检测各组细胞sirt3、FOXO1及抗氧化蛋白锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和抗氧化蛋白过氧化氢酶(CAT)表达,采用专用试剂盒检测SOD和CAT活性.结果 与正常组(0.66±0.01)比,miR-384模拟物组和si-sirt3组细胞内活性氧(ROS)水平显著升高[分别为(37.3±1.13)和(10.4±0.36),P<0.01];与HFFA组(29.4±0.98)比,HFFA/miR-384抑制剂组细胞ROS水平显著降低[(12.8±0.41),P<0.01];与正常组(0.75±0.04)Hepa1-6细胞sirt3蛋白表达水平比,HFFA组显著降低[(0.23±0.01),P<0.01];与HFFA组比,HFFA/sirt3组显著增加[(0.83±0.03),P<0.01];与HFFA/sirt3组比,HFFA/sirt3/miR-384组显著降低[(0.46±0.02),P<0.01];与对照组比,miR-384模拟物组Hepa1-6细胞sirt3蛋白、Forkhead转录因子O亚家族(FOXO)成员FOXO1蛋白表达显著减少[分别为(0.2±0.01)和(0.3±0.01),P<0.01],而CAT和MnSOD表达显著增加[分别为(2.3±0.05)和(2.4±0.06),P<0.01];与HFFA组比,HFFA/miR-384抑制剂组Hepa1-6细胞sirt3蛋白和FOXO1蛋白表达显著增加[分别为(0.5±0.02)和(0.7±0.01),P<0.01],MnSOD和CAT表达水平显著降低[分别为(1.6±0.04)和(2.0±0.03),P<0.01];与NAFLD组SOD(327±3.45)和CAT(386±4.03)活性比,正常组SOD和CAT[分别为(425±5.49)和(512±6.04),P<0.01]和miR-384抑制剂组SOD和CAT活性[分别为(406±4.79)和(447±5.38),P<0.01]显著升高.结论 miR-384表达可导致HFFA诱导的Hepa1-6细胞氧化损伤加重,部分可能是通过抑制sirt3/FOXO1途径实现的.
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L-选择素与小鼠肝癌细胞Hepa1-6淋巴道转移的关系
目的 研究L-选择素(L-selectin)与其配体甘露糖受体(mannose receptor,MR)间相互作用与小鼠肝癌细胞Hepa1-6淋巴道转移潜能相关性.方法 构建含有L-selectin的重组载体pcDNA3.1,转染小鼠肝癌细胞 Hepa1-6,筛选稳定表达L-selectin的细胞株.采用免疫组化、RT-PCR、流式细胞、体外黏附试验技术研究小鼠肝癌细胞Hepa1-6中L-selectin的表达及其与肿瘤细胞淋巴道转移潜能的相关性.结果 1重组质粒为目的基因L-selectin.2 Hepa1-6细胞表面有L-selectin表达,阳性率20.2%.3流式细胞仪检测结果表明Hepa1-6细胞表达L-selectin为19.9%.4体外黏附试验结果表明,不具有转移特性的Hepa1-6表达L-selectin后可发生淋巴道转移,L-selectin能与MR结合(P<0.001),介导Hepa1-6的淋巴道转移.结论 Hepa1-6表达目的基因L-selectin后具有淋巴道转移潜能,并能与MR在体外结合,介导肿瘤细胞的淋巴道转移.
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丹酚酸B对肝癌细胞的体外抑制作用及基本机制
目的 观察丹酚酸B对小鼠肝癌细胞hepa1-6的抑制作用及其基本机制.方法 以hepa1-6细胞培养为体外模型,用MTT法检测丹酚酸B对hepa1-6细胞的细胞毒作用,然后以Annexin V法用流式细胞仪检测丹酚酸B诱导hepa1-6细胞死亡的机制,以荧光定量PCR法检测丹酚酸B对hepa1-6细胞凋亡相关基因Bc1-2和BaxmRNA水平的影响.结果 丹酚酸B在12.5ug/ml以上对hepa1-6细胞有明显的细胞毒作用,其TC50为31.9ug/ml.在25-50ug/ml之间,诱导hepal-6细胞凋亡率为27.58％～74.26％,在37.5ug/ml浓度时可以使抑制凋亡基因Bc1-2mRNA显著降低,使促进凋亡基因BaxmRNA显著升高.结论 丹酚酸B对小鼠肝癌细胞hepa1-6具有显著体外抑制作用,其机制主要是诱导细胞凋亡.
