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梯度过表达文献资料
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以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法
目的 利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系.方法 利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列.以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP.将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒.以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系.将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系.结果 测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列.免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系.相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P＜0.01.结论 利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型.该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系.
