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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A下调抑癌基因PTEN的表达
目的 萤虫素酶探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)对抑癌基因PTEN表达的影响.方法 表达HCV NS5A的质粒(pCNS5A)转染QSG-7701细胞,采用间接免疫荧光法观察HCV NS5A蛋白的表达.构建PTEN启动子驱动的萤虫素酶报告基因表达质粒PTEN-Luc,并与pCNS5A共转染QSG-7701细胞,萤虫素酶实验检测HCV NS5A对PTEN启动子活性的影响.采用RT-PCR和Western blot分析分别观察HCV NS5A对PTEN mRNA和PTEN蛋白表达水平的影响.结果 转染pCNS5A的QSG-7701细胞胞浆中可见HCV NS5A蛋白表达.PTEN-Luc与不同剂量的pCNS5A质粒共转染QSG-7701细胞,HCV NS5A表达组的PTEN-Luc相对活性下降,且转染HCV NS5A质粒的剂量越大,PTEN-Luc的相对活性越低.转染pCNS5A的QSG-7701细胞内PTEN mRNA和蛋白质表达均较对照组下降,且随着HCV NS5A质粒剂量增大,PTEN mRNA和PTEN蛋白表达下降更明显.结论 HCV NS5A通过抑制PTEN启动子的活性而抑制PTEN基因的转录和PTEN蛋白的表达,这可能是HCV所致原发性肝细胞癌的发病机制之一.
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HCV NS5A抑制剂研究进展
近年来抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制的直接抗病毒药物得到了快速的发展,HCV非结构蛋白5A(NS5A)抑制剂由于抗病毒活性强、清除病毒快速和抗病毒谱广的特点成为了HCV抑制剂研究的新热点.本文综述了2010年以来有关HCV NS5A抑制剂研究的主要进展,并从化学结构角度出发,对不同化合物的药学特点进行分别阐述和归纳总结.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A抑制剂的研究进展
临床上丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)抑制剂联合聚乙二醇-干扰素/利巴韦林的治疗方案具有较高的持续病毒学应答获得率和耐受性,同时NS5A抑制剂的研究极大地推动了HCV治疗中不依赖干扰素治疗方案的发展.本文综述NS5A抑制剂的特性及其临床研究进展.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) 非结构蛋白5A 抑制剂 -
丙肝病毒非结构蛋白基因NS5A的克隆化
目的 克隆化非结构蛋白基因NS5A.方法 根据NCBI的Genbank上公布的HCV-1b型基因序列,设计PCR产物为NS5A的特异性引物,以HCV-1b型RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1341 bp片段, 连接至pGEM-T载体并送测序,测序结果表明NS5A已克隆成功.结果 成功克隆了丙肝病毒非结构蛋白基因NS5A.结论 NS5A是一种典型的病毒基因组编码的多功能蛋白,NS5A的克隆化为进一步研究NS5A的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
关键词： 丙型肝炎病毒 非结构蛋白5A 反转录-聚合酶链反应 -
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究
目的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究.方法依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其基因利用多聚酶链反应技术(PCR)进行克隆化研究.结果发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4.结论这一发现,为阐明HCVV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP2(615)蛋白反式调节基因
目的:对新基因NS5ATP2(615)转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我们研究组通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选得到的新基因NS5ATP2(615)的全长编码序列,构建NS5ATP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615).应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:确定基因NS5ATP2(615)由615nt组成,编码204aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5ATP2(615)表达质粒转染的细胞有40条差异表达基因,其中18条基因表达增强,22条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5ATP2(615)生物学功能及HCV NS5A的致病机制提供了理论依据.
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NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究
目的:应用酵母双杂交技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A-TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1).方法:应用酵母双杂交系统3,构建NS5A-TP5诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有x-g-gal营养缺陷型培养基(SD/Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.结果:挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析,新基因的开放读码框架长度为240个核苷酸(nt),编码产物由79个氨基酸残基(aa)组成,命名为NBP1,GenBank注册号为AY459291.结论:NBP1的筛选与克隆,可为进一步研究HCV NS5A-TP5蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因2的克隆化研究
目的:对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)蛋白反式激活靶基因2(NS5A-TP2)的基因作克隆化研究.方法:依据我室构建的HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因NS5-ATP2的编码序列,对其氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究.结果:NS5A-TP2基因编码区为615核苷酸(nt),编码产物为204氨基酸残基(aa).经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,说明我们克隆的NS5A-TP2基因属于未知功能新基因.结论:发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为研究新基因的生物学功能及慢性丙型肝炎发病机制提供新的思路.
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应用白细胞表达型cDNA文库的酵母双杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的结合蛋白
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)与白细胞来源蛋白的相互作用,探讨HCVNS5A对于病毒致病的机制及对机体免疫的影响.方法:构建HCV NS5A的酵母细胞表达载体,采用酵母双杂交系统筛选人白细胞cDNA文库,利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:获得了53个与NS5A特异性结合的阳性克隆,包括jun B原癌基因、Mob-1、制瘤素M、肌球蛋白IF、小囊泡结合膜蛋白的结合蛋白等16种已知蛋白基因,和2个未知功能基因.结论:NS5A可与一些白细胞特异性蛋白和信号转导组分发生结合,为HCV所引起的肝内外疾病机制的研究提供线索.
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华南HCV1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析
目的 构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性.方法 以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况.扩增产物中无MIu Ⅰ和Bcl Ⅰ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中.结果 成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NSSA区ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确.序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高；V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率.结论 成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A与干扰素的应答耐受
丙型肝炎病毒是丙型病毒性肝炎的病原体,目前缺乏有效的疫苗.干扰素是其主要治疗药物,但普遍存在耐受.丙型肝炎病毒非结构蛋白5A在丙型肝炎病毒的干扰素耐受中发挥重要作用.涉及的可能机制包括:非结构蛋白5A干扰素敏感决定区变异、抑制双链核糖核酸依赖性蛋白激酶、抑制2,5-寡腺苷酸合成酶、诱生白介素-8和作用于干扰素的蛋白酪氨酸激酶和转录激动子信号途径.
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丙型肝炎病毒NS5A基因在自然感染过程中的准种动态
干扰素敏感决定区(ISDR)的准种特性与干扰素的疗效密切相关[1].体外研究发现,野生型的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)能与干扰素(内源或外源的)诱导的双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)结合并相互作用,从而抑制PKR的抗病毒活性[2].部分揭示了NS5A与HCV持续感染的关系.为了进一步调查ISDR,PKR-BD,V3和NS5A其他功能区的变异情况,本研究从7例慢性丙型肝炎患者10年前与10年后血清中扩增并克隆NS5A基因,进行序列分析发现,野生型干扰素敏感决定区毒株在所有感染者中具有选择优势.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A及其结构域Ⅱ对小鼠肝细胞糖异生的影响
目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A (NS5A)及其片段NS5A结构域Ⅰ、结构域Ⅱ、结构域Ⅲ调节小鼠糖异生的机制.方法 60只C57BL/6J雄性小鼠随机分为6组,分别将小鼠肝细胞特异性表达重组全长NS5A蛋白及其片段NS5A结构域Ⅰ、结构域Ⅱ、结构域Ⅲ的慢病毒颗粒经C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射制备动物模型,以未注射组和注射增强绿色荧光蛋白慢病毒颗粒组为阴性对照.检测全长NS5A蛋白及其片段对小鼠空腹血糖及空腹胰岛素水平的影响;取小鼠肝组织制备石蜡切片,免疫组织化学方法检查小鼠肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达水平;实时荧光定量PCR (qRCR)和(或)Western blot方法检测小鼠肝组织NSSA、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和PEPCK的表达水平.结果 与未注射组(0.65±0.28)和(或)注射EGFP慢病毒颗粒组(0.87±0.36)相比,注射重组全长NS5A (1.79±0.64)和NS5A结构域(2.24±0.69)Ⅱ慢病毒颗粒的小鼠空腹血糖和胰岛素抵抗指数明显升高(P＜ 0.01);免疫组织化学和qRCR检测显示糖异生的关键酶PEPCK的表达量明显增多;Western blot检测结果显示NS5A蛋白和NS5A结构域Ⅱ抑制了磷酸化AMPK (Thr172)的水平、提升了SREBP-1和PEPCK的水平.结论 NS5A蛋白和NS5A结构域Ⅱ可能通过调节AMPK/SREBP-1/PEPCK而影响小鼠肝细胞糖代谢,NS5A结构域Ⅱ可能在HCV感染引起肝细胞胰岛素抵抗中起重要作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5a对细胞周期的影响
丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎、肝硬化的主要病因之一,并与肝细胞癌的发生关系非常密切.但HCV导致原发性肝细胞癌的机制,特别是其基因产物(结构蛋白和非结构蛋白)在致癌中的作用仍不清楚.HCV非结构蛋白5A(NS5A)能激活多种转录因子,并与细胞内因子结合,影响其功能,导致细胞增殖分化异常,可能与原发性肝细胞癌的发生有关.为进一步探讨它们之间的联系,采用放线菌素D(Act.D)作用于HepG2肝癌细胞株研究HCV NS5A对细胞周期调控的影响,从而为阐明HCV参与肝细胞癌的分子机制积累更多的资料.
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HeLa细胞中HCV NS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)NS5A的表达对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响.方法:将稳定转染的HeLa-NS5A和HeLa-NS5A-ΔISDR细胞在6孔培养板中培养24h后,加入人基因工程α2a型干扰素(rHuIFN-αt2a)至所需浓度.培养24h后加入VSV,继续培养相应时间.取培养上清液,按10-1稀释,50μL稀释液加入含Vero细胞的24孔培养板中.每孔加入含100 mL/L小牛血清的DMEM-7.5g/L羧甲基纤维素钠(CMC)1 mL.继续培养48 h后移走培养液,结晶紫染色,自来水轻柔洗净,记录噬斑形成单位(PFU).结果:干扰素(IFN)浓度为1×105 U/L,VSV对HeLa-NS5A细胞的致病变作用要比对HeLa-NS5A-ΔISDR细胞的致病作用更明显.在整个IFN浓度处理中,HeLa-NS5A细胞培养液中的病毒滴度是HeLa-NS5A-ΔISDR细胞培养液中的病毒滴度的2～5倍(P＜0.05).结论:NS5A能增强IFN敏感病毒的复制,HCVNS5A内的ISDR可能是造成IFN对HCV患者治疗效果的因素.
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GST pull-down联合质谱筛选丙型肝炎病毒蛋白NS5A结构域Ⅰ的相互作用蛋白
目的 对1b型丙型肝炎病毒Con1株的NS5A结构域Ⅰ宿主相互作用蛋白进行鉴定分析,为研究NS5A功能及其参与病毒复制机制提供理论基础.方法 构建pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒,诱导表达GST-Con1-NS5 A-35-215融合蛋白并纯化.采用GST pull-down联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对其相互作用蛋白进行鉴定,并使用OmicsBean在线软件对Con1-NS5A-35-215相互作用蛋白进行GO功能富集分析和信号通路分析.结果 在Huh7.5.1细胞裂解液中鉴定到547个潜在相互作用蛋白.GO功能富集分析发现相互作用蛋白主要参与细胞运输、应激反应、凋亡、蛋白泛素化等生物学过程.信号通路分析发现相互作用蛋白主要参与蛋白酶体、糖代谢、氨基酸合成、RNA转运等通路.通过免疫印迹验证了Con1-NS5A-35-215可与ACBD3和Vps35结合.结论 NS5A结构域Ⅰ通过其相互作用蛋白参与多种生物学过程,如调控细胞内运输、应激反应、蛋白稳态等过程.与ACBD3和Vps35相互作用的NS5A的片段缩短为35-215.
